1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 47
Текст из файла (страница 47)
Разнообразие и единство генетических механизмовПри использовании конъюгационного метода трудно ставить реципрокные скрещивания. В связи с этим картирование на короткихучастках обычно проводят с использованием трансдукции при помощи умеренного фага Р 1.Об относительном расположении маркеров при трансдукции судят по частоте совместного включения маркеров в частицу бактериофага (котрансдукции) при селекции трансдуктантов по одномуиз них. Аналогичные данные можно получить при трансформации.Трансформацию и трансдукцию, а также учет частот рекомбинации при конъюгации обычно применяют для картирования на коротких участках бактериальной хромосомы. Общее расположениегенов на хромосоме обычно определяют в опытах по прерываемойконъюгации.На основе этих принципов построены карты бактерий кишечнойгруппы — Е.
coli и S. typhimurium. Е. coli в генетическом отношениинаиболее изученный бактериальный объект. К концу XX в. на ее хромосоме было картировано около 2000 генов, что составляло около50% всего генома в соответствии с последующими данными.Для многих бактерий применимы не все три перечисленныхподхода к генетическому анализу, поскольку не у всех известна, например, конъюгация. Тем не менее построены генетические картыPseudomonas, Bacillus subtilis, Proteus mirabilis, Shigella.
В связи сповышенным интересом к азотфиксирующим бактериям проводятгенетические исследования Azotobacter, Clostridium, цианобактерий.Построены генетические карты симбиотических с растениями азотофиксирующих бактерий Rhizobium (рис. 10.9).В настоящее время предпочтение отдают прямому секвенированию геномов бактерий, определяя расположение генов на основании методов структурной и функциональной геномики (см. раздел16.11).Особенность карт бактериальных геномов — тесное сцеплениемежду генами, контролирующими близкие функции (см., например,рис. 10.5, а также 10.9): синтез триптофана, биотина, гистидина,пуринов, усвоение галактозы, арабинозы и др.
Эти скопления, иликластеры, генов отражают существенный момент генетической организации бактерий и связаны со способом регуляции действия ихгенов (см. гл. 17).10.5. Генетика бактериофаговБактериофаги, или вирусы бактерий, весьма разнообразны. Лучше всего изучены мелкие мужские бактериофаги Е. coli. Они пред-бактериофагов259'’*4cVs~4qarg-imet-5trp'15,2oРис. 10.9. Генетическая карта Rhizobium leguminozarum (no J. Beringer et al., 1978)ставляют собой фаги, содержащие РНК: R17, f2, MS2, Q|3. Их геномсостоит всего из 4-5 генов и упакован в белковую оболочку в формемногогранника. Такую же форму имеют частицы бактериофагов срХ174, генетическим материалом которых служит однонитевая ДНКразмером в 5375 нуклеотидов.
Эти вирусы имеют всего 10 генов.Другие однонитевые (ДНК) фаги — fl, fd, М13 — имеют нитевидную форму. Крупные бактериофаги — X, Т2, Т4 — содержат двунитевую ДНК, на которой располагается около 100 генов. МолекулаДНК фага X состоит из около 49 тыс. п. о., а ДНК так называемыхТ-четных фагов (Т2, Т4) состоит из 182 тыс. п. о. Они имеют многогранную головку и хвостовой отросток, на конце которого находитсяаппарат адсорбции и впрыскивания ДНК в бактериальную клетку(рис.
10.10).Специфическая особенность бактериофагов, как и вирусов, — та,что вне клетки они представляют собой инертные образования. Ихспецифическая активность проявляется только при инфицированииклеток. Поэтому генетика бактериофагов связана с генетическими260 фЧасть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовРис. 10.10. Электронная микрофотография фагов Т4, адсорбированных на поверхностиE.coli (L. D. Simon, Т. F. Anderson, 1967)особенностями бактерий-хозяев. Признаки бактериофагов, доступные генетическому анализу, — это прежде всего скорость и полнота лизиса инфицированных клеток и круг бактерий-хозяев, поражаемых фагами. Широкое распространение в генетическом анализебактериофагов получили мутанты с условным проявлением.
Это мутанты, чувствительные к повышению и понижению температуры, —так называемые термочувствительные (ts) и холодочувствительные(cs). Они нормально размножаются и лизируют клетки только припермиссивной температуре (37 °С).В качестве условных используют также мутанты, чувствительныек действию определенных супрессоров, находящихся в геноме бактерий. Это класс так называемых sus (от англ.
suppressor sensitive)мутантов. iSks-мутанты можно получить практически по любомугену, кодирующему белок. (О природе супрессоров с широким спектром действия, используемых в этих исследованиях, см. гл. 16.)Генетический анализ бактериофагов основан на совместномзаражении клетки генетически различающимися частицами бактериофага. Полные фаговые геномы, проникая в клетку, экспресГлава 10. Процессы, ведущие к рекомбинации у бактерий и бактериофагов#261сируют заложенную в них информацию подобно гомологичнымхромосомам, и таким образом становится возможным исследование взаимодействия аллелей одного гена и разных генов. Еслидва температурочувствительных мутанта, проникших в бактериальную клетку, несут изменения, способные взаимодействоватькомплементарно (см.
гл. 3), то в непермиссивных условиях клеткилизируются.В ходе репликации геномов возможна рекомбинация, в результатечего появятся рекомбинанты дикого типа. Их можно учесть, высеваяфаговое потомство на чувствительные бактерии в условиях, непермиссивных для родительских бактериофагов.Генетический анализ бактериофагов сопряжен с рядом трудностей, определяемых особенностями их развития в клетке. Репликация геномов Т-четных фагов идет экспоненциально со временем генерации 2-3 мин.
Вплоть до образования количества фаговой ДНК,эквивалентного 50 полным геномам, зрелые частицы фага в клеткене обнаруживают. Затем из общего фонда синтезируемой ДНК фаговые геномы начинают расходоваться на образование зрелых частиц.При лизисе клетки в ней остается еще столько же ДНК, скольковключилось в головки фагов.В процессе репликации фаговые геномы претерпевают неоднократные циклы спаривания, рекомбинации и репликации. В результате наблюдаемая частота рекомбинации всегда выше ожидаемой.В подобных многократных циклах репликации фаговых геномовгенетические события должны быть проанализированы с позицийпопуляционной генетики (см. гл.
20). Такой подход разработалиН. Висконти и М. Дельбрюк. При этом они исходили из следующихосновных положений: 1) в общем фонде ДНК родительские геномыфагов полностью перемешаны; 2) каждый геном фага аналогиченцелой хромосоме; 3) при репликации происходят неоднократныеспаривания и рекомбинации.В соответствии с этими допущениями получается, что геномыТ-четных бактериофагов проходят около 5 циклов спаривания и рекомбинации. Однако вызывает сомнение универсальность и надежность исходных допущений. Так, множественность инфекции однойклетки (и тем самым соотношение родительских частиц) может колебаться до 10 раз.
Лизис индивидуальных зараженных клеток обнаруживает неравенство реципрокных классов рекомбинантов.Тем не менее все эти трудности преодолимы, если жестко контролировать соотношение вводимых в клетку геномов фага и время репликации и рекомбинации. При этом можно применять стандартную262 #Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовлогику анализа рекомбинации вдвух- и трехмаркерных скрещиваниях.На основе этого подхода построены генетические картыбактериофагов срХ174, ф80, X, которые представляют собой кольцо, соответствующее кольцевойструктуре генома этих бактериофагов (рис.
10.11 и 10.12).Благодаря знанию генетикидвух близких умеренных бактериофагов X и ф80 (рис. 10.12)удалось получить их гибриды,Рис. 10.11. Генетическая карта бактериофага <рХ174 (из F. Ayala, У. Kiger, 1980)совмещающие свойства как X,Обратите внимание на то, что ген Етак и (р80. Так, ф80 в отличие от Xнаходится в пределах гена В, а ген В —интегрирует с хромосомой Е. coliв пределах гена Авблизи гена trp (синтез триптофана). Получены гибриды, интегрирующие как в сайте att X — между gal и Ыо, так и в сайте attф80 — около trp.При сопоставлении генетической карты фХ174 и его полной нуклеотидной последовательности согласно принципам, которые будут изложены позднее (см.
гл. 16 и гл. 20), удалось установить, чтодва гена этого бактериофага (В и Е) полностью перекрываются сдвумя другими генами (А и D). Мы вернемся к этим фактам в главе16.Кольцевая карта рекомбинации построена и для Т-четного фагаТ4 (рис. 10.13), у которого геном в действительности представленлинейной молекулой ДНК. Этот парадокс объясняется тем, что геномы Т4, упакованные в частицы фага, имеют так называемую концевую избыточность, что допускает кольцевые перестановки, иликольцевые пермутации генов.
Дело в том, что в головке Т4 заключено ДНК примерно на 1% больше, чем соответствует одному геномуфага. Дополнительные, концевые, участки фаговой ДНК и составляют физическую основу концевой избыточности. При зараженииклетки между такими молекулами ДНК происходят рекомбинации собъединением нескольких геномов в конкатемеры. Длинные молекулы ДНК, состоящие из нескольких геномов, далее реплицируютсяи рекомбинируют вновь. При созревании бактериофага Т4 работает принцип «наполнения головки». При этом нарезаются молекулыГлава 10. Процессы, ведущие к рекомбинации у бактерий и бактериофагов$8 263Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
