1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 48
Текст из файла (страница 48)
10.12. Генетическая карта бактериофагов к (снаружи) и <р80 (внутри) (поВ. Н. Рыбчину, 1982)ДНК, в которых наблюдаются концевая избыточность и кольцевыепермутации генов (рис. 10.14).10.6. Рестрикции и модификации ДНК бактериофаговВ молекулах ДНК, полученных из разных источников, встречаются модифицированные основания, например 5-метилцитозин,6-метиламинопурин и др. Они не включаются в ДНК при репликации ДНК как таковые, а появляются в результате ферментативноймодификации синтезируемых молекул, начиная со стадии фрагментов Оказаки. При этом модификация затрагивает основания, занимающие определенное положение в молекуле.
Эти реакции осуществляют ферменты, представляющие собой часть единой системырестрикции-модификации. Модификация определенных основанийпредохраняет ДНК от разрушения рестриктирующими эндонуклеазами, которые имеют сродство к тем же последовательностям ну-264 #Часть 2. Разнообпаъи*и „лгенетических механизмов-----------------------------------ивоинствоРис. 10.13. Генетическая карта бактериофага Т4 (по W. Wood and Н. Revel, 1976)клеотидов, что и ферменты модификации.Рестрикция-модификация фагов была открыта в начале 50-х годовXX в С.
Лурия, Г. Бертани и Дж. Уэйглом при изучении способности бактериофага X размножаться на различных штаммах Е. coli. Этоявление затем было подробно исследовано В. Арбером (рис. 10.15).Если заразить штамм Е. coli К12 выращенным на штамме Е. coli сбактериофагом X (назовем его X С), то в этом случае фаг размножается с низкой эффективностью, составляющей 0,002 % от эффективности размножения на Е.
coli С. В то же время бактериофаг X изштамма Е. coli К12 (назовем его X К) одинаково хорошо размножается на обоих штаммах. Редкие потомки X, развившиеся на Е. coli К12,Глава 10 flp°4eccbl’ ведущие к рекомбинации у бактерий и бактериофагов123456789012А1234567890121234567 89012Б12 3 * 5 6 7 8 9 0 1 21$2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 21234567690123456789012В265Рис. 10.14. Конкатемеры промежуточные продуктысинтеза ДНК фага Т4, которые,созревая, дают концевуюизбыточность и кольцевыеперестановки геновА — инфицирующий геном;Б — репликация;В — рекомбинация;Г — дальнейшая репликация ирекомбинация с образованиемконкатемеров;Д — упаковка ДНК, сопровождающаяся нарезаниемгеномов с концевой избыточностью и кольцевыми перестановками геновРис.
10.15. Рестрикция и модификация бактериофага X, контролируемая клеткойхозяином (по Г. Стенту, 1974)также способны высокоэффективно размножаться на Е. coli К12 и С.Разная эффективность размножения на Е. coli К 12 была единственным отличием фагов X К и X С. По всем другим характеристикам онибыли идентичны. Редкие частицы X С, развившиеся на Е.
coli К 12, небыли мутантами. В противном случае, снова пройдя цикл размножения на штамме Е. coli С, они не должны были терять способности266 *Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовТаблица 10.2Последовательности ДНК, узнаваемые некоторыми рестриктирующимиэндонуклеазами (по F. Ayala, J. Kiger, 1980)ИсточникE .coli KY13ФерментУзнаваемая последовательность *EcoRl15'G A A *СТТHind II15’ GT РуСА*РиHind III15’A*AGТ ТСН. influenzaeHpa IН. parainfluenzaeНра IIН.
aegyptiusHae III15’ GTTСАА15’ С С*GG15’ GGСС‘кТ ТС З’A* AGтРиА* С 3’РуТ GтСТТЗ’GAA*тА А С З’TTGТG G 3’С*СтС С З’GGт* Основания, модифицируемые метилированием. Короткими стрелками показаны разрезы,наносимые эндонуклеазой. Длинная вертикальная стрелка — ось симметрии.Ри — пурин, Ру — пиримидин.эффективно размножаться на Е. coli К12 (рис.
10.15). Кроме того,было отмечено, что частота появления редких частиц бактериофагаиз клеток Е. coli К12 при заражении их А, С варьирует в зависимостиот физиологического состояния культуры.Эти факты указывали на то, что сами клетки Е. coli К12 ограничивают размножение А С и в то же время модифицируют частицы АС таким образом, что они становятся способными эффективно размножаться на Е. coli К 12.В дальнейшем выяснилось, что один и тот же штамм может осуществлять несколько типов рестрикции и модификации. Из клеток,способных к рестрикции, были выделены эндонуклеазы, специфичные к определенным нуклеотидным последовательностям неадек-Глава 10.
Процессы, ведущие к рекомбинации у бактерий и бактериофаговФ 267ватно модифицированной ДНК. Эти ферменты широко применяютв работах по генной инженерии (см. гл. 12).Ферменты модификации защищают ДНК хозяина от действия эндонуклеаз рестрикции (от англ. to restrict — ограничивать). При этомодна и та же молекула может претерпевать разные типы модификации ДНК. Так, можно заразить мутант штамма Е.
coli В, утерявшийспособность к рестрикции, но сохранивший способность к модификации, фагом X К, несущим утяжеляющую метку. Методом центрифугирования в градиенте плотности в лизатах таких клеток можнообнаружить частицы бактериофага, несущие одну из родительскихцепей ДНК и совмещающие типы модификации, характерные дляштамма К и для штамма В.Существенную роль в модификации ДНК играет метионин. Еслииндуцировать лизогенный по фагу X и ауксотрофный по метионинуштамм Е. coli на среде без метионина и добавить эту аминокислотулишь в конце латентного периода, то ДНК значительной части фаговоказывается немодифицированной.
Выяснилось, что в ходе модификации донором метальных групп служит S-аденозил метионин.При изучении очищенных эндонуклеаз рестрикции, или рестриктаз Е. coli К и бактериофага Р 1, выяснилось, что они переносят метальные группы с S-аденозилметионина на немодифицированнуюДНК, после чего она становится устойчивой к рестрикции. Такимобразом, по крайней мере в некоторых случаях функции рестрикциии модификации совмещены в одном ферменте.Структура многих сайтов рестрикции-модификации в настоящее время расшифрована. Эти сайты представлены короткиминуклеотидными последовательностями, характерная черта которых — их симметричность (см.
табл. 10.2). Система рестрикциимодификации — это своеобразный барьер, охраняющий клетку отвключения в ее генетический материал чужеродных молекул ДНК.Возникновение мутантов, лишенных способности к рестрикции, открывает дополнительные возможности для изменчивости за счет ассимиляции клеткой чужеродной генетической информации. Крометого, некоторые рестриктазы (например Eco R1) могут осуществлятьсайт-специфическую рекомбинацию плазмид в клетках Е. coli.Успехи генетического анализа у микроорганизмов, особенно у бактерий и бактериофагов, сыграли революционизирующую роль в методахизучения структуры и функций генетического материала.
Организациягеномов бактерий и пути, ведущие к их рекомбинации, оказались, напервый взгляд, совершенно отличными от того, к чему привыкли генетики, работавшие с эукариотами. У бактерий были открыты дополни-268 «Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовтельные (к хромосоме) генетические элементы: плазмиды и эписомы.Некоторые эписомы существуют в свободной форме. Это бактериофаги, вся структура которых приспособлена к переносу генома междуклетками.
Другие плазмиды способны только к репликации в бактериальной клетке. Между этими крайними формами есть промежуточныеварианты. Само существование таких дополнительных элементов генома поставило вопрос о возможности их использования для переносагенетического материала, и не только между клетками бактерий.Применение методологии генетики бактерий к изучению эукариот (клонирование клеток, применение трансформации, использование рестриктирующих эндонуклеаз и т. д.) стало основой синтетического направления в биологии — генетической, или генной,инженерии, о которой подробнее сказано в главе 12.Вопросы к главе 101.
Почему при конъюгации бактерий требуется разное время для образования рекомбинантов по разным маркерам?2. Частота котрансформации по устойчивости к стрептомицину ипенициллину приблизительно равна произведению частот трансформации по каждому из маркеров. Частота котрансформациипо устойчивости к стрептомицину и по способности сбраживатьманнит превосходит в 17 раз произведение частот трансформации по каждому из этих маркеров. Как объяснить эти факты?3. Какие типы трансдукции вам известны?4. Может ли клетка F~ превратиться в клетку F*? Hfr? Каким образом?5. Почему генетическая карта Е. coli имеет кольцевую форму?6. Почему генетическая карта бактериофага Т4 имеет кольцевуюформу?7.
Что такое мерозигота? Что такое гетерогенота?8. Можно ли исследовать комплементарное взаимодействие генов убактерий? Если да, то каким образом?9. Возможна ли трансдукция при помощи литического бактериофага?10. Чем и почему генетические карты различных штаммов Hfr Е. coliотличаются друг от друга?11. Что такое эндонуклеазы рестрикции?12. В чем сходны и чем отличаются явления трансформации и трансдукции?13. Как соотносятся расстояния между маркерами на хромосомеЕ. coli, выраженные в минутах, частотах рекомбинации и парахоснований ДНК?Глава 11.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
