1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 46

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 46)

Кроме того, умеренные бак­териофаги могут мутационным путем превращаться в вирулентные,что подчеркивает относительность данной классификации.Общая, или неспецифическая, трансдукция. Трансдукциюосуществляют умеренные бактериофаги. К их числу относится ифаг Р22, при помощи которого Н. Зиндер впервые обнаружил транс­дукцию у Salmonella typhimurium.Два штамма этой бактерии, нуждавшиеся в аминокислотах (один —phe trp tyr + +, другой — + + + met his), высевали в смешанной куль­туре на минимальную среду. В результате появились прототрофныеколонии с частотой около 1 х ЮЛ Как видно, логика экспериментабыла та же, что и при поисках конъюгации у Е. coli (см.

раздел 10.1).На сей раз, правда, иными оказались результаты выращивания двухназванных штаммов S. typhimurium в разных отростках U-образнойтрубки, разделенных бактериальным фильтром. Рекомбинанты былиполучены и в этом случае. Следовательно, для их образования не ну­жен контакт между клетками, как при конъюгации.Оказалось, что фильтрующийся агент, переносящий гены, этоумеренный бактериофаг Р22, по которому был лизогенным один изштаммов, изученных Н. Зиндером и Дж.

Ледербергом. Посколькуфаг Р22 мог трансдуцировать любые гены сальмонеллы, это явлениеназвали общей, или неспецифической, трансдукцией. Как показал в1955 г. Е. Леннокс, такой же способностью обладает и бактериофагPI Е. coli. Этот фаг переносит очень небольшой фрагмент хромо­сомы Е. coli. Например, совместную трансдукцию генов thr и leuнаблюдали только в 1 % случаев, т. е. одна фаговая частица из 100,трансдуцирующих ген thr, несла и ген leu, хотя на генетической кар­те Е. coli, построенной при конъюгации, эти локусы тесно сцепленыи находятся на расстоянии около 2 % общей длины генома.Общая трансдукция оказалась следствием включения фрагментовДНК Е.

coli, зараженной фагом Р 1, в инфекционные частицы бактерио­фага. Причем такие частицы вообще не содержат или содержат оченьмало фаговой ДНК. Вследствие этого трансдуктанты, возникающиепри множественности инфекции, равной 1 (одна частица на однуклетку), оказываются нелизогенными и не обладают иммунитетом кфагу Р1. Дефектность трансдуцирующих частиц Р1 подтверждает ито, что трансдукцию могут осуществлять даже вирулентные мутан­ты Р1.

Это показывает, что трансдуцирующие частицы действительноне способны инициировать нормальный цикл развития фага. ИначеГлава 10. Процессы, ведущие к рекомбинации у бактерий и бактериофагов253клетки, зараженные вирулентным мутантом фага Р1, должны были быпогибнуть. Перенос генов при общей трансдукции может привести кдвум различным состояниям трансдуктантов. В одних случаях при­внесенный ген наследуется стабильно, поскольку интегрирует с хро­мосомой реципиента. Это — полная трансдукция.В других случаях — при абортивной трансдукции — внесенныйфагом фрагмент генома не реплицируется и передается по однойлинии при размножении трансдуктанта, т.

е. из двух клеток — по­томков каждого деления, лишь одна получает трансдуцированныйген. Так, в частности, можно трансдуцировать ген, определяющийналичие жгутика S. typhimurium. В этом случае во всем клоне — по­томстве трансдуктанта— жгутик, а следовательно, подвижность,сохраняет только одна клетка. Абортивная трансдукция происходитчаще, чем полная, иногда в 10 раз.Возможные варианты отношений между умеренным бактериофа­гом и клеткой при общей трансдукции показаны на рисунке 10.7.Специфическая трансдукция отличается от неспецифическойтем, что бактериофаг может переносить только определенные гены,как это характерно для фага X Е. coli, который может трансдуциро­вать только гены локуса gal, ответственного за усвоение галактозы,и bio — гены синтеза биотина.

Явление специфической трансдукцииоткрыли в 1956 г. М. Морзе и супруги Э. и Дж. Ледерберг. Умеренныйбактериофаг X при лизогенизации Е. coli интегрирует в ее хромосо­му на участке между локусами gal и bio. Это было показано в конъюгационных скрещиваниях бактерий: лизогенных Hfr и нелизогенныхF~. Трансдуктанты Gal1 возникают обычно с частотой 1 х Ю МО-6и, как правило, генетически нестабильны. Они выщепляют клеткиGal~ * с частотой около 2 х Ю_3 на клеточное деление.

Это явлениеобъясняется тем, что трансдуктанты G a t частично гетерозиготныgal/gat, т. е. несут дополнительный фрагмент gal+вместе с участкомgal реципиента. Такое состояние называется гетерогенотой.При облучении гетерогенот ультрафиолетовым светом удалосьполучить фаголизаты, способные к трансдукции с очень высокой ча­стотой. Почти половина всех частиц X могла передавать признак Gal+при трансдукции. Изучение фагов из таких лизатов, названных HFT* В обозначении генотипа и фенотипа микроорганизмов приняты трехбуквенныесокращения.

При изображении генотипа рецессивные аллели — строчные, а доми­нантные — прописные буквы или строчные со знаком «+». При изображении фе­нотипа первая буква прописная, остальные две — строчные; при этом знак «+» или« -» означает наличие или отсутствие изучаемого свойства. Так, символ Gal пока­зывает, что клетки бактерии не способны утилизировать галактозу.254 *Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовРис. 10.7.

Отношения умеренного бактериофага и бактериальной клеткиА и Б — литический цикл; В — лизогенизация; Г — полная трансдукция; Д — абор­тивная трансдукцияГлава 10. Процессы, ведущие к рекомбинации у бактерий и бактериофагов255R Qitgali n t x is N im m O PZT~\Q RAFL I j___b io—1---------- -СИ —►■—*---- L-1----- *—1—J—1--- ■Е .с о П (Х )IРис. 10.8.

Схема интеграции и эксцизии генома бактериофага к за счет сайт-специфической рекомбинации с хромосомой Е.coliи образование трансдуцирующих частиц(от англ. High Frequency Transduction), показало, что гены gal пере­носят так называемые дефектные фаги X, т. е. такие, которые, лизогенизируя бактерии, сообщают им устойчивость к суперинфекции X,но в дальнейшем лизогенные бактерии не способны продуцироватьинфекционные частицы бактериофага. Дефектные трансдуцирующиечастицы X, обозначаемые X gal, не образуют стерильных пятен на га­зоне Е. coli. Они не могут самостоятельно размножаться.

Для этого имтребуется фаг-помощник: нормальный, не способный к трансдукции.У дефектных фагов X gal от 1/4 до 1/3 собственного генома заме­щены на участок gal бактериальной хромосомы. Общая схема лизогенизации Е. coli бактериофагом X и образования трансдуцирующихчастиц представлена на рисунке 10.8.256 &Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовСайт-специфическая рекомбинация. Геном фага А.

проникаетв бактериальную клетку в линейной форме, однако на концах ли­нейной молекулы ДНК есть так называемые липкие концы — однонитевые участки по 12 нуклеотидов, комплементарные друг другу.В клетке ДНК X замыкается в кольцо. В таком виде она интегрируетв геном бактерии. Принцип этой интеграции предложен А. Кэмпбел­лом в 1962 г.: кольцо генома X реципрокно рекомбинирует с коль­цом бактериальной хромосомы. Один обмен приводит к интеграцииДНК фага X с ДНК бактериальной хромосомы.В дальнейшем оказалось, что интеграция профага может проходитьтолько в одном месте на хромосоме Е. coli, названном att X (attachmentsite X). Аналогичный участок есть в геноме бактериофага.

Такая реком­бинация происходит в отсутствие протяженного участка гомологии. Об­щим у фага и бактерии оказалась последовательность всего в 15 п. о.:.GCTTTTTTATACTAА...(показана только одна цепь ДНК).Вырезание (эксцизия) профага из хромосомы осуществляется потому же механизму реципрокной, сайт-специфической рекомбина­ции (рис. 10.8).

Как интеграцию, так и эксцизию профага контроли­руют два фаговых гена: int и xis.Сайт-специфическая рекомбинация происходит точно, но не без­ошибочно. Приблизительно один раз на 1 млн при эксцизии профагарекомбинация осуществляется не в сайте att, а захватывает участкиgal или bio. Так возникают трансдуцирующие частицы, у которыхчасть генетического материала профага замещена генами бактерии(рис. 10.8).

Во всех этих случаях в рекомбинацию вовлекаются теже последовательности из 15 пар оснований, которые встречаютсяв генах gal и bio. За пределами этих 15 п. о. гомология отсутствует.Очевидно, что механизм сайт-специфической рекомбинации прин­ципиально отличается от механизма кроссинговера, рассмотренногов гл. 8. Сайт-специфическую рекомбинацию проводит фермент интеграза, кодируемый локусом int фага X.10.4. Генетический анализ у бактерийГенетический анализ у бактерий основан на использовании про­цессов, ведущих к рекомбинации: конъюгации, трансформации,трансдукции, а также на переносе генетического материала с помо­щью плазмид — факторов F, факторов устойчивости и др.При конъюгации в клетку-реципиент переносится обычно мень­ше половины бактериального генома, и очень редко весь геном.

Притрансдукции размеры переносимого фрагмента определяет емкостьГлава 10. Процессы, ведущие к рекомбинации у бактерий и бактериофагов#257оболочки бактериофага, но они не превышают 1/100 длины хромо­сомы Е. coli, т. е. составляют участки до 4,6 х 104 п. о. При транс­формации фрагменты, включаемые в геном бактерий, имеют сопо­ставимую длину: от 1,5 д о 20 х 103 п. о. Таким образом, «зигота»бактерий всегда является частичной зиготой, или мерозиготой.Конкретные задачи генетического анализа диктуют выбор тогоили иного метода введения генетического материала в клеткиреципиенты.

Так, прерываемая конъюгация позволяет установитьпоследовательность генов на хромосоме. Однако этот метод неудо­бен при картировании маркеров, разделяемых 1-2 мин карты. В этихслучаях необходимо картирование по трем точкам, которое прово­дят как на основе конъюгации, так и на основе трансдукции илитрансформации. Для интеграции линейного фрагмента, внесенногов клетку, требуется двойной кроссинговер с кольцевой хромосомой.При конъюгационном картировании предварительные данныео грубой локализации исследуемого гена с помощью прерываемойконъюгации позволяют выбрать селективный маркер, по которомуотбирают рекомбинантов.

Такой маркер должен находиться за пре­делами исследуемого участка — дистально по отношению к точкеначала переноса бактериальной хромосомы. При этом исследуемыйген или гены вводятся с фрагментом хромосомы Hfr. Клетки F так­же должны иметь селективный маркер (например, устойчивость кстрептомицину), для того чтобы отбирать клетки-реципиенты, в ко­торых и происходит рекомбинация.Предположим, что при скрещивании Hfr ABC х F~ abc селектив­ным маркером служит ген А и при этом неселектируемый ген В об­наружен у 95% рекомбинантов, а ген С — у 60%. Это показывает,что частота рекомбинации между А и В составляет 5 %, а между А иС — 40 %. Так же можно установить частоту совместного наследо­вания В и С среди рекомбинантов по гену А — 35 %.

Таким образом,порядок расположения генов А — В — С и расстояния между нимиаддитивны.Сравнение физической карты Е. coli, построенной в опытах попрерыванию конъюгации, и рекомбинационной карты показыва­ет, что 1 мин соответствует 20 единицам рекомбинации.

Посколькувся хромосома передается за 100 мин, ее общая рекомбинационнаядлина составляет 2000 единиц, а с учетом общего количества ДНКв хромосоме (4,6 х Ю6п. о.) единица рекомбинации соответствуеток. 2 тыс. п. о. Расчеты показывают, что рекомбинационное картиро­вание разумно применять на расстояниях не более 3 мин, посколькуна больших расстояниях маркеры будут наследоваться независимо.258 *Часть 2.

Характеристики

Список файлов книги