1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 45
Текст из файла (страница 45)
10.3). С тех пор этот метод получил широкое распространение, ирасстояния на генетической карте Е. coli измеряют в минутах.Кольцевая структура генома. Оказалось, что различные штаммы Hfr переносят гены в клетки-реципиенты в разной последовательности. Сопоставление этих последовательностей показало, чтовсе они согласуются с единой круговой генетической картой.
Кольцевая структура генома Е. coli была подтверждена в исследованияхДж. Кэйрнса, получившего радиоавтографы ее реплицирующейсяхромосомы (рис. 10.4). Единая кольцевая молекула генома Е. coli содержит около 4640000 п. н. (4288 генов). Она может дополнительно включать фактор F, имеющий в свободном состоянии кольцевуюформу и состоящий из 60 тыс. п. н., а также другие плазмиды, профаги и иные необязательные элементы.Интеграция фактора F может происходить в разных точкахбактериальной хромосомы. Это определяет начало и направление передачи генов у разных штаммов Hfr (рис. 10.5). Весь геном246 *Часть 2.
Разнообразие и единство генетических механизмовАРис. 10.3. Опыт Ф. Жакоба и Е. Вольмана по прерыванию конъюгации у Е. coli (поФ. Жакобу и Е. Вольману, 1961)А — схема переноса хромосомы; Б — зависимость появления рекомбинантов отдлительности конъюгацииЕ. coli переносит при конъюгации при 37 °С за 100 мин, однакоэто происходит очень редко. Известно несколько штаммов Hfr,способных к передаче полного генома (всей «хромосомы»). Ихназывают также vHfr (от англ.
very high frequency recombination —Глава 10. Процессы. веду щие к рекомбинации у бактерий и бактериофаги*Ф 247очень высокая частота рекомбинации). Только в результате переноса всей хромосомыклетки-реципиенты приобретают свойства донора.Репликация при конъюга\ции. Взаимоотношения эписомыF и бактериальной хромосомыможно представить следующимобразом.
В клетках F отсутствует фактор F. Клетки F' в результате потери фактора F становятся клетками F . Перенос фактораIF в клетки F превращает их вtклетки F +. Возможна интеграция\фактора F с бактериальной хромосомой, и тогда при конъюгации она переносится в реципиенты F . У штаммов Hfr факторF интегрирован с хромосомой.Рис.
10.4. Радиоавтографическое изображение реплицирующейся хромосомыФактор F — представитель болееЕ. coli, полученное Дж. Кэйрнсомширокого класса конъюгативных(по Г. Стенту, 1974)плазмид, обнаруженных у разныхВидны две вилки репликации, движущие бактерий. Эти плазмиды способны мобилизовать хромосому прися в противоположных направлениях.Справа вверху — графическая реконконъюгации и передавать ее реструкция этой картиныципиентам.Присутствие фактора F определяет образование на клетках Е. coli половых ворсинок, или пилей,играющих активную роль при конъюгации. Они есть у F и у Hfr,но не у клетокИменно на этих половых ворсинках адсорбируются бактериофаги, специфичные к мужским клеткам, или «мужские»бактериофаги. Это РНК-содержащие фаги: R17, MS2, QP, f 12, атакже фаги с одноцепочечной ДНК: fd, f 1, М 13.
Половые пили, повидимому, необходимы для удержания конъюгирующих бактерийвместе.Обычно автономный фактор F при размножении бактерий реплицируется, подобно бактериальной хромосоме (см. рис. 10.4), образуя0-образные фигуры в качестве промежуточного продукта репликации. Установление конъюгационного контакта между клетками, возможно, служит сигналом для активации или синтеза ферментов, уча-248 «Часть 2.
Разнообразие и единство генетических механизмовг^\>Ь X■ V A^V 6QО 'Рис. 10.5. Генетическая карта E.coli (Г. Стент и Р. Кэлиндар,1981)Стрелки на внутреннем кольце — точки интеграции фактора F и направление переноса хромосомыствующих в переносе ДНК, в частности ферментов, разрывающиходну нить в ДНК фактора F.Однонитевой разрыв появляется в точке oriT отличной от точкиобычной инициации репликации фактора F. Если скрещиваются F+иF , то освобождаемый в результате такого надреза 5'-конец цепи ДНКначинает «разматываться» и проникает в клетку F . Таким образом, вдонор попадает одноцепочечная копия фактора F, которая там реплицируется и превращается в двуцепочечную форму, замыкающуюся вкольцо.
То, что в клетки F~ передается только одна цепь фактора F,показано с помощью так называемых мини-клеток Е. coli.У этой бактерии есть штаммы F~, в значительном количестве образующие абортивные клетки размером около 10 % от нормальных илишенные нуклеоида. Это и есть мини-клетки. Они не способны реплицировать ДНК.
После конъюгации с клетками F+из мини-клетокбыли выделены одноцепочечные копии ДНК фактора F.Глава 10. Процессы, ведущие к рекомбинации у бактерий и бактериофагов$8 249HfrВHfrJРис. 10.6. Мобилизация бактериальной хромосомы при конъюгациик — интеграция фактора Р, Б — инициация репликации по механизму катящегосякольца; В — перенос одной нити в клетку-реципиент (Р ) с репликацией по механизмукатящегося кольцаЕсли фактор F интегрирован с хромосомой, то при конъюгациинадрез фактора F инициирует ее репликацию по механизму катящегося кольца (или разматывающегося рулона) и передачу однонитевой копии хромосомы в клетку-реципиент (рис.
10.6). Это такжебыло продемонстрировано с помощью мини-клеток. Таким образом,при конъюгации часть фактора F передается вместе с первыми маркерами, а часть — с самыми последними, что бывает очень редкоиз-за разрывов конъюгационного канала и переносимой ДНК.Факторы F ’ и сексдукция. Вырезание (эксцизия) фактора F изхромосомы штамма Hfr иногда бывает неточным, и тогда участокбактериальной хромосомы замещает участок фактора F. Образуетсятак называемый F ’- (F-прим) фактор; он становится способным переносить бактериальные гены независимо от хромосомы, но вместесо свойствами донора. Это явление называется сексдукцией.
Благодаря сексдукции можно получать у Е. coli частичные диплоиды (меродиплоиды) по тем генам, которые включены в фактор F ’. Таким250 &Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовобразом, возможно исследование аллельных отношений и эффектовувеличения дозы гена у бактерий, что в какой-то мере компенсируетотсутствие у них регулярной диплоидной фазы.Между гомологичными участками на факторе F ’ и хромосомевозможна рекомбинация, которая будет приводить к образованиюклеток Hfr с дупликацией бактериальных генов в случае одиночногокроссинговера или к реципрокному обмену генами между F ’и бактериальной хромосомой в случае двойного кроссинговера.10.2.
ТрансформацияТрансформация бактерий — это перенос наследуемых признаковиз одних клеток в другие с помощью ДНК (см. гл. 5). При трансформации ДНК, выделенную из клеток одного штамма, поглощают клеткидругого штамма — реципиента. С помощью генетических маркеровоб этом можно судить по изменению фенотипа реципиента.Трансформация возможна у целого ряда бактерий: Streptococcus,Hemophillus, Neisseria, Bacillus, а также у актиномицетов, цианобактерий и других и имеет общие закономерности.
Лучше всего онаизучена у таких бактерий, как S. pneumoniae, В. subtilis, Н. influenzae.В процессе трансформации рассматривают следующие стадии. Длятого чтобы ДНК проникла в бактериальные клетки, они должны находиться в состоянии компетентности. Установлению компетентности, приобретаемой лишь частью клеток культуры обычно в середине логарифмической стадии роста, способствует особый белок.В присутствии хлорамфеникола — ингибитора белкового синтеза — состояние компетентности не развивается. В то же время антибиотик, добавленный к компетентной культуре, компетентности неподавляет.
Следовательно, белок, стимулирующий компетентность,вырабатывается во время роста культуры.Сначала компетентные клетки связывают ДНК на своей поверхности. Обычно трансформирующая ДНК имеет молекулярную массу около 1 х 107 Д, что составляет около 0,5% бактериальной хромосомы.
ДНК, связанная с компетентными клетками, расщепляетсяспециальными нуклеазами до фрагментов с молекулярной массой4-5 х 106 Д. После этого фрагменты ДНК проникают в клетку. Некоторые бактерии, в частности пневмококки, могут неспецифическипоглощать ДНК из разных источников. Другие бактерии, напримерHemophillus, поглощают только свою, гомологическую ДНК.Фрагменты менее 5 х Ю5 Д в клетку не проникают.После попадания в бактерию двунитевая ДНК превращается воднонитевую: одна нить ДНК деградирует. На заключительной ста-Глава 10. Процессы, ведущие к рекомбинации у бактерий и бактериофагов251дни происходит интеграция одноцепочечного трансформирующегофрагмента с ДНК клетки-реципиента.
При этом репликация не требуется, и включаемый фрагмент физически объединяется с ДНКреципиента. Весь процесс трансформации завершается в течение10-30 мин. Частота трансформации разных бактерий составляетоколо 1 %.Для некоторых бактерий показана трансформация в естественных условиях, например в организме инфицированного животногодля S. pneumoniae, а также в условиях культуры — для В. subtilis.Это означает, что трансформация — не экзотический прием генетического анализа, а естественный биологический процесс.С развитием генной инженерии широко применяется плазмидная,или векторная, трансформация, которая заключается во введении вклетки бактерий, а также эукариот генов, интегрированных в естественные или искусственные плазмиды (см.
гл. 12).10.3. ТрансдукцияТрансдукцией называют перенос генов из одних бактериальныхклеток в другие при помощи бактериофага.Это явление в 1951 г. открыл Н. Зиндер — ученик Дж. Ледерберга. Прежде чем обратиться к трансдукции, необходимо рассмотретьвзаимоотношения между бактериями и бактериофагами.Вирулентные и умеренные бактериофаги. Бактериофаги, иливирусы бактерий, делят на две категории: вирулентные и умеренные.Вирулентный бактериофаг (или просто — фаг), проникая в клетку,вызывает литическую реакцию, т.
е. размножается и лизирует бактерию. Умеренные бактериофаги могут вызывать как литическую,так и лизогенную реакцию. В последнем случае инфицирующий фагпереходит в состояние профага, который воспроизводится синхронно с хромосомой бактерии. Бактерии, несущие профаг, называютлизогенными. Лизогенные бактерии приобретают иммунитет, т. е.устойчивость к дополнительному заражению тем же бактериофагом,который их лизогенизировал.Лизогенное состояние устойчиво воспроизводится. Профаг приэтом теряется с частотой около 1 на 105—106 клеточных делений.В лизогенных культурах может происходить индукция бактериофага, в результате чего наблюдают массовый лизис бактерий.
Индукцияпроисходит спонтанно, ее также стимулирует целый ряд агентов, повреждающих ДНК: ультрафиолетовые и рентгеновы лучи, алкилирующие соединения, азотистый иприт, органические перекиси и т. д.Следует подчеркнуть, что, заражая бактериальную клетку, умерен252 &Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовный фаг может вызвать как литическую, так и лизогенную реакцию.Вероятность того и другого варианта развития событий зависит отфизиологического состояния культуры.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
