1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 44
Текст из файла (страница 44)
Внутренние мембраны также отсутствуют. Единственноеисключение — фотосинтетический аппарат цианобактерий, располагающийся на уплощенных мембранных мешках — тилакоидах,сходных с тилакоидами пластид. В отличие от растений у бактерийони не заключены в специальную органеллу, а лежат непосредственно в цитоплазме.Основные различия генетической организации прокариот и эукариот представлены в таблице 10.1.Именно простота организации прокариот объясняет быстрыйпрогресс в изучении генетического аппарата бактерий, к которымгенетики обратились только в начале 40-х годов XX в. С 1944 по1952 гг. у бактерий были расшифрованы три основных процесса,Глава 10.
Процессы, ведущие к рекомбинации у бактерий и бактериофагов241приводящие к объединению ирекомбинации генетического материала: трансформация, конъюгация и трансдукция.Все эти способы «гибридизации» бактерий используют в ихгенетическом анализе в зависимости от целей, которые ставитперед собой экспериментатор.10.1. КонъюгацияКонъюгациейназываетсянепосредственныйконтактмежду клетками бактерий, соЦ(Р)провождаемый переносом генетического материала из клетокдонора в клетки реципиента.Процесс конъюгации у бактерий Escherichia coli (кишечнойпалочки) был открыт в 1946 г.Рис. 10.1.
Схема строения делящейсяДж. Ледербергом и Е. Тэйтумомпрокариотической клеткиКС — клеточная стенка; КМ — клеточна основании генетического подхода. При этом исследователиная мембрана; Н — нуклеоплазма, илинуклеоид, имеющая фибриллярнуюруководствовались следующимиструктуру; Ц (Р) — цитоплазма, заполпринципами, ставшими затемненная рибосомами и имеющая зерниклассическими при обнаружестую структурунии полового процесса у любыхмикроорганизмов.1. Необходимо работать со штаммами одного вида бактерий.2. Следует учитывать различия по нескольким стабильным признакам.3.
Для получения гибридов или рекомбинантов необходимо применять метод селективных сред, для того чтобы регистрироватьдаже очень редкие события. В отношении первых двух положений эта методология восходит к правилам менделевского гибридологического анализа (см. гл. 1).В соответствии с изложенными принципами Дж. Ледерберг иЕ. Тэйтум взяли два штамма Е. coli, маркированные несколькимимутациями ауксотрофности:I thr leu thi ++II +++ bio met242 *Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовТаблица 10.1Различия генетической организации прокариот и эукариот (по Р.
Стейниеру,Э. Эдельбергу и Дж. Ингрэму, 1979, с изменениями)Особенность организацииЭукариотыПрокариоты+->1*1*+Хромосомы содержат гистоны+-Ядрышко+-Митоз+-Мейоз+-Органеллы, содержащие ДНК+-Слияние гамет+-Нуклеоплазма окружена мембранойЧисло хромосом* — часть генетической информации могут содержать плазмиды — автономныегенетические элементы (см. с. 244).— Rodobacter, Agrobacterium.+Первый штамм нуждался в треонине, лейцине и тиамине, а второй —в биотине и метионине.
Реверсию, т. е. восстановление прототрофности,по отдельным признакам наблюдали с частотой около 1 х Ю 7. Следовательно, выбранные штаммы могли бы ревертировать к дикому типу, т. е.к полной прототрофности с частотой 1 х 10-14 - 1 х 10-21, если реверсиипо всем признакам происходят независимо друг от друга.Эти штаммы смешали в жидкой полноценной среде и инкубировали в течение 24 ч. После этого смесь высеяли на так называемуюминимальную среду, не содержавшую тех соединений, в которыхнуждались исследуемые бактерии. Около 100 клеток на каждые 109высеянных образовали колонии, т.
е. прототрофы появились с частотой 1 х Ю~7, что значительно превосходит (на 7-14 порядков) частоту спонтанного ревертирования. Следовательно, эффект обусловленименно совместным инкубированием двух штаммов и представляетсобой какой-то вариант полового процесса.Поскольку трансформация уже была известна (см. гл.
5), необходимо было выяснить, не имели ли Дж. Ледерберг и Е. Тэйтум дело странсформацией. Оказалось, что обработка одного штамма фильтратом среды, в которой выращивали другой, не приводила к появлениюпрототрофов, так же как и выращивание двух штаммов в разных отсеках U-образной трубки, разделенной посередине бактериальнымфильтром. Эффект наблюдали только при непосредственном контакте бактерий, и его не подавляла ДНКаза.Глава 10. Процессы, ведущие к рекомбинации у бактерий и бактериофагов#243Обнаружение полового процесса у бактерий вызвало целый рядвопросов.
Что представляют собой продукты гибридизации? Гаплоидны они или диплоидны? Какова роль гибридизуемых штаммов вэтом процессе и можно ли говорить о половой дифференцировке?В какой форме осуществляется рекомбинация?Вскоре были получены ответы на все эти вопросы.Гаплоидность продуктов гибридизации бактерий. В эксперименте Дж. Ледерберга и Е. Тэйтума могли быть учтены диплоидныегибриды или гаплоидные рекомбинанты. Чтобы решить эту дилемму, вскрещиваемые штаммы ввели еще одно различие: устойчивость (V1) —чувствительность (Vs) к бактериофагу (бактериальному вирусу).Если продукты гибридизации диплоидны, то они будут проявлятьодну и ту же реакцию на бактериофаг: все они будут устойчивы,либо чувствительны, либо обладать каким-то промежуточным уровнем устойчивости в соответствии с законом единообразия гибридовF].
В действительности среди прототрофных колоний (продуктов гибридизации) 36% были устойчивы, а 64% — чувствительны к бактериофагу. Следовательно, в эксперименте учитывали гаплоидныхрекомбинантов, а диплоидная стадия отсутствовала или была оченькратковременна.Перенос генетического материала от донора к реципиенту.В 1952 г. У. Хейс провел реципрокные скрещивания между штаммами Е. coli, устойчивыми и чувствительными к стрептомицину (Strrи Str5):IStrs thr leu thi + + x Str' + + + bio metII Str* thr leu thi + + x Strs + + + bio metДля учета рекомбинантов смесь клеток высевали на две среды: сострептомицином и без него.
При первом скрещивании рекомбинантыпоявились только на среде без стрептомицина, а при втором — какна среде со стрептомицином, так и без стрептомицина. Следовательно, для образования рекомбинантов необходимо сохранение клетокродителя: thr leu thi + +, который обозначили как женский (F~), аштамм + + + bio met — как мужской (F+).Рекомбинация происходит в клетках F~ — реципиентах, а клетки F+— доноры — передают генетический материал в клетки F~.В 1958 г.
Т. Андерсон доказал это прямым методом, скрещивая клетки, различавшиеся морфологически. Клетки F~ круглые, a F+— продолговатые, благодаря чему контакт между ними можно наблюдатьв микроскоп (рис. 10.2). Кроме того, изолируя клетки после конъюгации, удалось показать, что только в потомстве бактерий F~ появляются рекомбинанты.244 &Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовКонтроль половой дифференцировки.
Эписомы и плазмиды.Оказалось, что среди штаммов Е. coli существует разнообразие почастоте образования рекомбинантов при скрещивании.1. При совместной инкубации любых двух штаммов F - рекомбинанты не образуются.2. При скрещивании F+и F~ рекомбинанты образуются с частотойоколо 1 х 10^-1 х ЮЛ При этом около 90% клеток F - за 1 ч превращаются в клетки F+. Следовательно, фактор F имеет инфекционную природу.
Он относится к категории плазмид — нехромосомных генетических детерминантов.3. В комбинации F+х f + рекомбинанты образуются с частотой1 х Ю-7 и реже. В действительности эти события отражают переход некоторых клеток F+в F~ с последующей конъюгацией между клетками F+и F~.4. Обнаружены также штаммы, которые при скрещивании с F~ образуют до 1 х Ю-1 рекомбинантов. При этом фактор F не заражает клетки F~.
Такие высокоэффективные доноры названы Hfr (отангл. High frequency recombination — высокая частота рекомбинации). Оказалось, что клетки F+ могут превращаться в клеткиHfr и обратно. В дальнейшем в большинстве экспериментов поконъюгации бактерий использовали доноры Hfr. Способностьбыть донором если и передается реципиенту при конъюгации соштаммом Hfr, то очень редко. В этом случае почти все рекомбинанты сохраняют свойства F . На основании этих данных былосделано заключение, что фактор F может объединяться с хромосомой Е. coli, интегрировать с ней.Таким образом, фактор F может существовать в двух состояниях:автономном и интегрированном.
Такие генетические детерминантыполучили наименование эписом. К их числу относится бактериофагX, геном которого после проникновения в бактерию реплицируетсяавтономно и лизирует клетки или встраивается в геном Е. coli и реплицируется вместе с ним в виде профага. Существуют эписомы,определяющие устойчивость к антибиотикам. Это факторы R. Онимогут «собирать» несколько генов устойчивости к разным антибиотикам и переносить их инфекционным путем между штаммами ивидами патогенных бактерий.Факторы R инфекционны подобно факторам F. Они были открыты в50-х годах XX в.
в период увлечения антибиотиками, повлекший за собой появление бактерий, устойчивых сразу к нескольким ингибиторам.Нехромосомные генетические детерминанты бактерий и эукариотобъединяют в более широкую группу — плазмиды. Поскольку факГлава 10. Процессы, ведущие к рекомбинации у бактерий и бактериофагов$8 245тор F и другие эписомы могутреплицироваться автономно, т. е.независимо от бактериальнойхромосомы, их также называютплазмидами, если они находятсявне бактериальной хромосомы.Перенос генов при конъюгации. Донор передает свои генетические маркеры реципиенту вопределенной последовательности с убывающей вероятностью.Это указывало на ориентированный перенос генетическогоматериала.Ф.
Жакоб и Е. Вольман в 1961 г.провели эксперименты по прерыванию конъюгации у Е. coli. ОниРис. 10.2. Конъюгация между клеткамисмешивали клетки F~ и Hfr приF *(Hfr - продолговатая) и F~ (круглая)37 °С в жидкой среде. Через равE.coli (по Г. Стенту и Р. Кэлиндеру, 1981) ные интервалы времени они отбирали пробы и встряхивали ихв гомогенизаторе при 4 °С, тем самым прерывая конъюгацию. Затемвысевали на среду для учета рекомбинантов по различным маркерам.Первые 8 мин рекомбинантов вообще не было, а затем они стали появляться в характерные для каждого маркера временные интервалы(рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
