Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.3 (522944), страница 165
Текст из файла (страница 165)
ТЬе гпоя чегза6!е оГ |Ье сттипо!Св!са! ТеаВепсз ачаПаЫе Гог десес6оп оГ йаохувеп!и-1аЬе!егс ргоЪез аге РАВ Егаатепсз оЕ апс(йаохуаешп пп!пипов1СЬВ1ш |Ьас Ьаче Ьееп соир1е|1 со аП|аПпе РЬозрЬасазе (ВоеЬппцег МаппЬеип). ТЬе Ьезс сЬго|поцепк ыЬзсгасез Еог сттипо1оса!ыег) а1ЬаПпе РЬозрЬасазе аге сЬе Ь|пагу геааепсз 5-Ьгото-4-сЫого-3-!пс)о1у! РЬозрЬасе (ВС1Р) апд 4-пПгоЫие сесгакоПит сЫогЫе (ЫВТ).
Рог п|оге шЕоггпасюп оп сЬезе геадеппь р1еазе зее ГЬе |пЕоггпаПоп рапе1 оп ВС1Р. 1)п|1ег орПгпа! сопй6опз, ъчЬеге Ь(ВЬ сопсепсга6опз (50 — 100 пд/тЦ оЕ йаохуаепсп-1аЬе1егС ргоЬе аге изе|1 ш ГЬе ЬуЬпйгасюп зсер ап!1 сЬе со1ог геасиопз аге шсиЬасег( Гог ехсеп|1е|1 Пп|ез (16 — 24 Ьоигз), |с Ь роза!Ые со с(есесс <1 ра оЕ !а!Вес Г)19А ш а !!ос-Ыос аыау (е.цо р!еазе зее Кег1йоЕ 1992). Но|чечег, Еаг Вгеасег зепя6чПу апс) а тоге 1шеаг гезропзе аге СЬ|аспес( сч!|Ь |Ье зо!иЫе сЬепи!шп|пезсепс зиЬзсгасе ас)атапсу! 1,2-г)юхесапе РЬозрЬасе (АМРРГЬ Тгор|х, 1псб КосЬе) (Кег)!ЬоЕ 1992; Вгопзсе|п ес а). 1993).
1п АМРРР 1шпшезсепс зузсегпз, |чЫсЬ Ьаче Ва)пег) гарЫ1у ш рори! апсу ш гесепс уеагз, геточа1 оГ сЬе РЬозРЬасе гезЫие Ьу аП|аПпе РЬозрЬасазе 56пи|1асез сЬе ыЬзсгасе со епш сЬепи!шшпезсепсе ас 477 пт, !чЬ~сЬ сап Ье гпеазигес) из(па а 1ит|потесег. ТЬе ППЬ| оссигз аз а 91о|ч ГЬас регязь сог зечега1 Ьоигз |п зо!исюп апгс Гог сопяссегаЫу 1опВег оп пу)оп шгЕасез (Т|хаг!1 ес а!. 1990).! тааез оГ Ыоь сап Ье сарсигес( оп Х-гау 61гп, оп Ро!агоЫ шзсапс Ыас)! апд |чЫсе 61п| (КНс1|а апс) ТЬогре 198Гг), оп а РЬозрЬог!тааег, ог оп а ССР сагпега (Кагцег ес а!. 1993). Ас |ь Ъезс, сЬепи1шшпезсепс г)есесссоп оГйаохуВешп-15Ье!ес) ргоЬез В Ь(ВЫу зепы6че (0.03 ра оГ сагаес РЫА ог КЬСА) апгс гарЫ (<30 пиписез ехрозиге).
ТЬе тесЬос( Ь сЬегеГоге -10-Го!6 пюге зепяПче ап!1 50-ЕоЫ Еазсег |Ьап аисогайюагарЫс десессюп оЕ '|Р-1аЬе!е!1 пис!ек асЫ ргоЬез. Еп а!Ыиюп, гергоЬ(па В я|пр66е!1 япсе зспрршд оЕ сЬе 6!сег гпау пос Ъе гег)и!Тес) (АПеВ ес а1. 1990). Аз а сопзессиепсе оГ сЬезе ас)чаи!Ввез, сЬепп!шпшезсепс амауз 1ог аП|а1ше РЬозрЬасазе !аЬеЬ аге сьед Еог с)есесс(оп оЕ сттоЪ|1)хес( пис!есс асЫ зециепсез |п а счЫе чапесу оЕ сесЬшг)иез |пчо!йпд Ыоссспа ап!1 РЫА зес(пепе!па. Рог пюге ш(огтасюп оп АМРРЕ| зузсетя р!еазе зее сЬе !ВЕоппа6оп раве! оп АМРРО. Епуогтаг(оп РапеЬ А9А! ВС1Р (5-Ьгоп|о-4-сЫого-3-ш|1о!у! РЬоврЬасе, ЕСсг.
370.4, (йвойщп ва1с(; ЕСвг. 433.6 с' о — ноа (со1шйпе ва!с() (в овес( ш сошЬ|пасюп |ч|сЬ пЬгоЫие-сесгахо1шш ва!с (ЫРТ) со с(есесс ад|а!ше РЬоврЬасаве !и яси. ТЬе Ь!пагу геадепс Еоппв!пво1иЫе ргес|рпасев ас ясев оЕ |'н ~-и' н аП|а1ше РЬоврЬасаве исси(су апс( (в сЬе гноя вепв!1(че |пйсасог ау|се|и ачадаЫе Еог сЬгогподешс |1есессюп оЕ аПга!ше РЬоврЬасаве сои)идасев. 1п сЬ~в геасдоп (Р|8иге А9-7), аП|а!ше РЬовРЬасаве саса1ухев |Ье геиюча1 оЕ |Ье РЬоврЬасе Вгоир Егоп| ВС!Р, 8епегасш8 5-Ьгошо-4-сЫого-3-!ис(о!у! Ьу|(гохйе, |чЫсЬ йгпег(аев со сЬе шво!иЫе Ыие сошроипй 5,5'-йЬгоп|о-4,4'-йсЫого|пйдо. ТЬе 1|чо гейк|п8 ег!шча1епш ргог(исег( г(ипп8 |Ье йшепгасюп геасдоп гес(исе опе п|о1еси!е оЕ шсгоЫие сесгахо!пип со |Ье |пво1иЫе, |псепве!у ригр1е ануе, йЕоппахап (Мсбас(еу 1970; Ргапс! апг( сгн(а! 1988).
Со1ог с(ече1оршеис оссигв очсг вес ега1 Ьоигв, Ъш |Ье спие гег!юге|1 со рго|!исе гпахипигп ядпа! чапе| сопя|(егаЫу, с(ерепйп8 оп |Ье апюипс оЕ апс(Ьог(у Ьоипг( со |Ье сагдес ию1еси!е. ВС!Р/1>!ВТ (в а вепядче г(есессог оЕ адгаПпе РЬоврЬа1аве асс(ч!су Ьис |в пос аванс(сас!че. ()паис(сас!че аяаув оЕ |Ье енсу|ив аге сагпес( ош ияп8 сЬе сЬгопюдешс | иЬвсаСе р-шсгорЬепу! РЬоврЬасе (МсСошЬ апг( Во|чесс 1972; Вг!с)гшап аис( Вес(гсч!1Ь !975; М|сЬае18 е1 а1. !983). ТЬ~в виЬ|1га1е (в во!8 Ьу 5!8ша ипс(ег О!РО!3МА2АС4 ВС!Р!СВРТ Соппв |пво!ише ригр!е ргес!р!1а1е а1 я1ев ос а!Кавпе рповрПа1аве асдчау 1агде1 014А !шгпоЬ8!хеб оп 181Ег АМРР0 !иш!Певсепс в серсигегС оп Х-гау 18гп, Ро!аго!и С!!гп, ог а рповрПопп|адег Х | | 9 Ьюдп 1агде1 0ПСА !пгпоЬ8!хеб оп С!!сег Р!СС)КЕ Ад-8 Оесесс!оп оЕ О!Похудеп!п- апсс В!оС!п-1аЬе1ег! П(ис1есс Ас(с! РгоЬев и(СЬ ВС!РЛЧРТ А9.42 Аррепг((х 9: Ресегпои цузсепсз сЬе пате "5(цта )зсо.
104 РЬозрЬасазе зиЬзсгасе." Нуйго!уяз оЕ Яцгпа 104 цепегасез р-пцгорЬепо1, счЬкЬ ш а|Р|еоы зо1шюв аЪзогЬз зсгопц!у ас 420 пт. А п|оге зепяйче Ью!шпспезсепсе-Ьазей аяау Ьаз а1зо Ъееп йезспЬей (М(з)са апй Се1цег $987) ш |чЫсЬ Р-1ис|Еейп-О-РЬозрЬасе ь изей аз а зиЬзсгасе. ТЬе апюипс оЕ! ис(Еег(п ге1еазей Ьу Ьуйго1уяз оЕ сце зиЬягасе |з сьгасей ышц! ис|Еегазе, апй ПцЬс ипри!зез аге |Ьеп гпеатгей ш а 1ипвпогпесег. 1п то!еси1аг с!опшц, ВС!Р!$4РТ Ь гчЫе1у ые|1 аз ап шсцсасог |и повгай(васс(че зузсепь со йесесс пис!ек асЫз ог ргосешз.
АЬпозс а1|чауз, сЬезе зузсегпз сопяя оЕ зечега! согпропевь |Ьас аге ыей ш зег(иепсе. ЪЪеп |чогЫпц ас |ь Ьезс, сЬе ВС1Р(ХРТ шгцсасог зузсегп ь зевяпче епоицЛ со йесесс япц!е сор|ез оЕ цепез (п 5оисЬегп ЬуЬгЫЬасюп оЕ соса! |папипацап Р)4А. Турка! аггавцегпепь аге зЬо|чп (п Нциге А9-8.
5ошЬегп, погсЬегп, апй йос Ыоь сап Ье геЬуЬг(й(сей Ьу зсПРР|пц |Ье ргес|риасе оЕ Еогтахап Его|п сЬагцей пу1оп 61|егз |чиЬ Аг,)9-й(тесЬу!Еогтат(йе. Мосе сЬас )ч',)чг-й(гпесЬу(Еогтат!йе з чарог Ь сгйсайпц со зЫп авй тисоиз тегпЬгапез апй зЬои1й сЬегеЕоге Ье ые|1 оп1у ш а |чеП-чепй! асей сЬегшса! Ешпе Ьоо|$. Р|цохуцепш-! аЬе1ей оццопис!еос(йе ргоЬез сап Ъе гепючей Егот гпетЬгапез Ьу Х)с(-й(|песЬу(ЕогтатЫе ас гоо|п сеп|регасые ог Ьу Ьеас|пц со 70-75'С ш а Ьи((ег сопса(в!вц ЫВЬ сопсепсгайопз оЕ 5Р5 (РйсЫепсЬ апй СЬигсЬ 1993).
ТЬе |петЬгапез сцеп сап Ье гергоЬей. СЬгоп|оцеп1с йесеспоп оЕ аП|ацпе РЬозрЬасазе 1з Еаг 1ея зепябче сЬап |Ье !ит(везсепс гпесЬо|$ ияпц сЬе зо1иЫе 1,2кПохесапе зиЬзсгасе АМРРР (5сЛаар ес а!. 1987). 1п сЬ~з зузсегп, |Ье зева(с(ч(су ш йос Ыоь ь (всгеазей Пот 0.2 рц ш 16 Ьоигз со 1 Ец ш 1 Ьош. 1п 5ои|Ьегп ЬуЬгЫиасюпз, ияпц АМРРР аз ап шйц сасог, сЬе зепяйчПу Ь -70 Ец |и 1 Ьоы (е.ц., р!еазе зее АПеь ес а!. 1990). 1п а|Ывюп со |ь ые аз ап |пгцсасог Еог аП|ацпе РЬозрЬасазе соп]ицасез, ВС(Р!$ч(ВТ Ьаз а!зо Ьееп ые|$ со |$есесс аП|а1ше РЬозрЬасазе ехргеме|$ |и зесйопз оЕ чегсеЬгасе сЬзиез (Еце!|Ь-Веггу ес а!. 1992) апй со Ыессс((у Ьассеьа! со1ошез |Ьас ехргея ВАР (ВпсЫпап апй Вес(счч(|Ь 1975; Еог геч(есч, р!еазе зее Мапо(1 ес а1. 1990). ВС1Р Ь зо1й аз а й(зой(игп за1с ог а со1шецпе за1|.
ТЬе со1шгцве за! с оЕ ВСГР Ь яисаЫе Еог ые ип|Ь сЬе сотгпегс(ацу ачацаЫе попгагПоасйче |(есесйоп зузсепь Еог пис1ек аеЫз ап|$ ргосешз. АМРР0 АМРРР (айатапсу!-1,2кцохесапе РЬозрЬасе а1зо 1|по|чп аз -[2'зр(гоайагпапсапе]-4-гпесЬоху-3-[З"- (РЬозрЬогу!)РЬепу(]1,2,-й(охесапе ог йьосПигп З-(4-гпе|Ьохузрпо[1,2-й(охесапе-3,2'-сг(сус1о- [3.3.1.|р]йесап]-4-у1)-РЬепу!РЛозрЬасе) ь а зиЪягасе ые|$ ш а!1|а!(ве-РЬозрЬасазе-сг(ццегей сЬепи1игп|- пезсепсе Еог |Ье |$есесйоп оЕ Ьюро1у|пегз ип|поЬ|1Ье|$ оп пу1оп ог Рз|РР гпегпЬгапез (Вгопзсеш апй Мсбга|Ь 1989; Вгопзсеш ес а1.
1990; Тьагй ес а!. 1990; СП1езр(е апй Ни|Ьре|Ь 1991). Бциге А9-9 зЬо|чз а сурка! Еогтас изей Еог |Ье йесес6оп оЕ ргосе(пз (п ъчезсегп Ыосйпц ап|$ Еог ЬуЬг(й(хас(оп оЕ иппюЪ|1Ьей пис!ек асиЬ. ТЬе зепяйчьу оЕ сЬепи!шпшезсепс йесессюп оЕ Р(з)А, ВЕ(А, апй ргосешз ияпц АМРРР ь зирегюг со ачацаЫе со!ойгпе|Пс, Ью1ипипезсепс, ог Пиогипеспс |песЬо|Ь апй Ь ас 1еазс ег)иа1 со сЬе сгагцйопа! аисогаецоцгарЫс сесЬш|!иез |Вас Ьаче |$опипасей пю!еси1аг с1опшц Еог сЬе 1ая 20 уеагз (е.ц, р!еазе зее Вес(с ап|$ Козсег 1990; Вгопзсе!и ес а!. 1990; Саг1зоп ес а1. 1990; Роцагй-КшцЫ ес а1. 1990). 1п зо1шюп, сЬе ПцЬс оисрш Егоп| сЬе асспйсу оЕ Ее|чег |Пап 1000 то1еси! ез (1 лпо!е ог 10 " пю(ез) оЕ аП|ацпе РЬозрЬасазе тау Ье гпеая|гей (5еЬаар ес а1. 1989). 1.ея сЬап 0.1 рц оЕ КНА ог Р)4А |пау Ье йесессе|$ |и зсап|(агй 5оисцегп ап|$ пог|Ьегп ЬуЬПсцхасюпз (е.ц, р1еазе зее Вес)г ес а!.
$989), |чЬегеаз <! Рц оЕ а сагцес ргосеш гпау Ье йесессей ш |чеяегп Ыоь оЕ соса! сеП ргосешз (061езр|е апй Ни|Ьре|Ь 1991). Р(циге А9-10 зЬо|чз |Ье ечепь сг(ццегей Ъу йерЛозрЬогу1асюп оЕАМРРР сЬас! еа|Ь |о сЬе рго|(иссюп оЕ 1$8Ь|. А]]сацпе РЬозрЬасазе сага!ухез сце геп|оча1 оЕ сЬе япц!е РЬозрЬасе геяйие оЕ АМРРР, цепегаПпц а тойегасе!у зсаЫе ецохесапе апюп |Вас Егацтепсз |псо айагпапсапопе апй |Ье ехс(се|$ зсасе оЕ а п|есЬу(- тесаохуЬепхоасе ашоп. Оп гесигп со цгоипй зсасе, сце апюп ет(сз ч(з(Ые, уецосч-цгееп ПцЬс (Вгопзсе|п ес а!. 1989).
ТЬе |$ерЬозрЬогу1асюп оЕ ецохесапез Ьу а((га1ше РЬозрЬасазе Ь г(и(се е(6е|епс |ч||Ь а сигпочег гасе оЕ -4.0 х 10' то!еси!ез з ' (5сЬаар, сце|$ ш Вес(с ап|1 КПяег 1990). Но|чечег, |Ье Ьа!$-Ие оЕ сЬе ехсией 1,2 гцохесапе ашоп Ь соспрагайче1у 1опц, чагув|ц (гоп| 2 пнписез со зечега! Ьоигз, йерепеПпц оп |Ье А9.44 Аррепг)(х 9: Ресегс(оп Вузсептз пмапо пмппо ОЕОЗ атаа НС()ВЕ А9-10 СЬепи1иш!пезеепС СепегаВоп о( Е!ВЬС Ьу РерЬозрЬогу!аВоп о1 АМРРР 477 птп птеспу!-пт-охуоепааате ап1оп адаваптапопе 140 120 100 80 тх 50 40 20 5 10 15 20 25 30 11пте, пт!и Е!С()ВЕ А9-11 К!пе()ез о( СЬепи1ипипезсепсе о( АМРРР 12 10 Яюитп аге йе )т!пес!сз г( сЬетп!!итп!пезсепсе о( аПсаПпе-рЬозрЬасазе-гаса!ухес) г)есогпроясюп о( АМРРР )и (А) 0.05 54 ЫсагЬопа(е) сагЬопатетт1 псМ МВС! (РН 9.5) ог (В) оп а Вюс!уе А тпепсЬгапе.
).иш!пезсепт гатез аге ехргеззес! аз ге!а6не ПВЬС ип!Ь (К).С)). (Керт!птес), ит!СЬ реггпьзюп, (гогп Т1хагг! е( а1. 1 990.) 8 3 5 4 птпе, Пт тПш!и!зЬез сЬе сепг)епсу от" сЬе 1,2 йохесапе со зе!ВаВВгецасе апс) гезспсь пз шсегасс!опз сч!сЬ пу!оп 01- сета. Ж!сЬ сЫз согпроипй сЬе Пгпе со геасЬ тпахипитп ПВЬс егпьяоп Ь шаг)тетПу гет)исет) ю сЬас чету япаП сртапППез о( сагВес пю1еси!ез сап Ье т)есессег) гарс01у (е.цп р)еазе зее Магьп ес а1. 199 Ц. СРР-5саг, а сЬсгт) 1,2-йохесапе зиЬзсгасе, тоПоъчз а т)есошроз!с(оп расЬсчау япйаг со сЬас от" АМРРР апс) СВРР, Ьш тс ргот)исез а яВпа! зечега! сппез Ьт!ВЬсег. ТЬе СРР-5слгяВпа! а1зо реа)сз еагПег ш сЬе геассюп апт1 регязь Гог !опВег (ир со зечега! т)ауз) сЬап йас от" тсз г)ча!з (зоигсе: Тгортх ЧтеЬ Ясе счппч. сгортх.сош).
ЬПсгосеП01озе ЕПсесз 1ас)с йе арргорг!асе Ьус)горЬоЪ!с зигтасез апт) аге сЬеге(оге пос гесошшепт)ес) (ог сье ит)сЬ еПЬег АМРРР, С5РР, ог СРР-Яап Ьоъчечег, Р ттРР сап Ье изет) сч!сЬ аП сЬгее. АМРРР ь ап ехсгепте!у зсаЪ|е сопсроиптЬ ТЬе асс!часюп епегВу Сот ть сЬегша! т)есошроз!с!оп !п Н О ь 21.5 )оса!! пю1е апг) Пз Ьа1ВЬЕе ас 25'С В -20 уеаь. Япсе попепгуспа6с Ьут)го)уз!з Ь чеку з1осч, йе Ьас14- Вгоипт) от' сЬепи1шпшезсепсе оп Ыосз Ь гпшипа).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
