Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.3 (522944), страница 134
Текст из файла (страница 134)
ТЬе сегпипа! ргодись оЕ йЬ геассюп аге а согпр1ех иихсиге оГ асЫ-яо1иЫе 5'-рЬоя- р р р р р р рЬогу1асес1 о1$8опис1еос(дея. зон р р р ря $4|ЬесЬег й|я пкЫп8 асс!ч(су оГ Р)ъ)аяе 1 ъйяр1ауя яе|)иепсе ярес(йсйу геша(пя а яигрпяш81у шиг)ъу Сорк, ъч(СЬ сопйкСш8 даСа сгош яечега1 Вгоиря. Оп йе опе Ьап|1, ЬюсЬеписа1 апа1уяЬ оЕ йе сййеяйоп ргодисЬ оГ Ьи1)ь Е.
сой Р!ъ(А яЬоъчя оп1у ъчеа[ь яеъ)иепсе яресгйсйу (ЕЬг1(сЬ ес а1. $973; Вегпагсй ес а1. 1975). Оп йе о|Ьег Ьапд, Еоосргшь Вепегасед Ьу д$8еяс(оп оЕ доиЫе-ясгапдед Р)ъ(А ъч(сЬ Р)ъ(аяе 1 ойеп яЬоъч ечЫепсе оЕ ргеГегепйа! с1еачайе Ьу |Ье епгуше. 1п а|Ыиюп, 5сЬей1ег ес а1. (1968) яЬоъче|1 сЬас Р)ъ)аяе ! Ьая а чегу |иаг1|е|1 ргеЕегепсе Гог с1еачш8 ро1у(д[А-Т!) ро1у(д[А-Т]) со йе 5' яде оЕ Т гея|1иея, а гери!с йас ъчая сопйппе|1 ъч(сЬ Ьоиюро!угиепс ро1у(д[А-Т!) Ьу 1ошопояяоЕЕ ес а1. (1981). Ноъчечег, й|я аррагепс ярес(йсйу гпау Ье |1ие июге Со а ярес|а! а1|егпайп8 В сопЕопиаСюп СЬоиВЬС Со Ье аяяос|аСед ъч)СЬ йе Ьоиюро!ушег, гайег йап со ргеЕегепсе оЕ йе епгугие Еог рапки!аг яеъ)иепсея (К!и8 ес а1.
$979). 5иррогс Гог |Ьь Ыеа сошея йош апа1уяя оЕ йе сгуяса1 ясгиссиге оЕ сошр1ехея Ьесъчееп Р)ъ)аяе 1 ап|1 яЬогс доиЫе-ясгапдед о1$8опис!ео|Ыея (5ис1| ес а1. 1984; 5ис)с апд Ое(пег 1986). Ап ехрояед 1оор оЕ йе епгуше Ь(пдя |и |Ье пипог Вгооче оЕ В-Р)ъ)А ъчиЬ Ъой ясгап|Ь оГ сЬе пис!ек асЫ Ьепсйпй со гиа1|е сои|асс ъч(сЬ сЬе епгугие. 5ис1| ес а1. ($988) Ьаче яи88еясед йас, ш сопсгая со йе геяи1ь оЕ 5сЬей1ег ес а1. (1968) апд Еошопояяо(Е ес а1. (1981), А-Т сгасся ш доиЫе-ясгапде|$ Р)ъ)А ииВЫ Ье ге1ас|че1у геяясапс со с1еача8е ъч(сЬ Р)ъ)аяе 1.
1п яишшагу, ъчЬейег Р)ъ)аяе 1 п(с1|я доиЫе-ясгап|1ед 17)ъ)А (и а яеъ)иепсе-дерепдепс ЕаяЬ- юп арреагя со Ъе |пйиепсед Ьу йе ясгиссиге оЕ |Ье сешр1асе. ТЬе епгуп|е (псгодисея пк1ся $псо сошр1ех Р)ъ)Ая ъч)сЬ !ииие|1 гейап1 Гог яеъ)иепсе. Ноъчечег, ои яупйейс о1$8опис!еос(дея оГ дейпед яеъ)иепсе, йе епгу|ие яЬоъчя а ЫВЬег дейгее оГ ргеГегепсе, регЬаря Ъесаияе йе соп(огшасюп оГ сЬеяе яиЬясгасея 1ип(ь ассеяя оГ сЬе епгуше со сегсаш с1аяяея оГ рЬоярЬосйеясег Ьопдя. А4.42 Аррепг(тх 4: Епеутег Иег( т Мо1еси)аг С!оптпе РКЕРАКАТ!ОЫ ОГ 0ЫАаг ТНАТ !$ ЕКЕЕ ОЕ КЧлаг гпКНА ргерагет) (гогп ип)п(естег( гпатгпа)(ап сеЬ сиота)пь оп(у егпа)! агпоип1ь о1 г)о пот соптрготпье пог1Ьегп ЬуЬг(г))ха1(оп ог о(Ьег (урез о( КНА апа)уа)ю Нотчече 6 огп (тапа(естес) гпаглгпа)(ап сеЬ ог 1гогп се)(а (п(естес) чч)1Ь 0)чА ч)гилаев аге сопта агпоипта о( 0ЙА (Ьа1 гпия1 Ье гегпочег) Ьу г))беат(оп чч)1Ь 0йаае !.
0п(от(ипате!у ргерагат)опт от рапсгеатгс 0)4аае 1, ечеп (Ьоье 1Ьа1 с(а)гп 1о Ье Кйаее-(гее, аге соп п)т)сап( агпоиптч о( ИЧаее. )и ай)(1(оп, 1Ье иае от согпгпегс(а))у ргерагег( Кйаь Ьесогпе ехрепяче ччЬеп гпапу аагпр(еь аге ргерагег(. 0йаье ! сап Ье тгеа1ег( Ьу Ьеа От' (ОГ)иаСЕта(Е 1О ГЕГ) иСЕ КйаЬЕ ает)Ч((У ЬУ -98)а ТЬЕ ГЕЕи )1(ПЕ РГЕРатат(ОГЬ О( 0)4аа а(! Ьит (Ье споет атг)пееп1 арр))сат(опт (е.а., (Ь)е гпе(Ьог) аЬои(г) пот Ье избег( то гегпо то Ье иеет( )п сопьтгист(оп от' а с0НА ))Ьгагу).
0йаае риг(т)ег) )и (ЬЬ птаппег еЬои! 1Ье ргееепсе о1 а рго1е)п (пЬ)Ь)тог о( Кйазе (р)еаае ъее гЬе (п(оггпатюп рапе! оп кьтаага (п СЬартег 2). 1. 0ьгю(че 10 тц о1 рапсгеат(с 01чаье (5(агпа) )и 10 гп! о(0 1 )а (ог(пасет)с ас(г(, ().т (рН 5.2). 2. Неа1 (Ье ьо(ийоп то 55'С (ог 45 гп)потев. Соо! (Ье яо!ит)оп 1о О'С, апг) асИ 1 хт СаС! (о арпа! соп- сеп1гатюп о( 5 гп)чт. 3. 0ьрепье 1Ье 0йаае ! (пто вгпа!! а))г(иота апт) ь1оге ат -20'С. Хис1еалег А4АЗ ВА$. 31 Ь)ллс!еа8е (4$$еготопах ехрерапа ВАЕ 31) ВА1. 31 ь ргебогпшапс1у а 3' ехопис!еаае гЬас гегпочеа пюпопис1еог)ъ$еа Егогп ЬогЬ 3' гегпип! оГ йе лъчо ягапда оЕ 1шеаг РХА. ВА1.
31 )а а!ао ап епъ)опис1еаае; ЕЬия гЬе япц1е-ягапс1еъ$ РХА цепегасе6 Ъу йе 3' ехопис1еаае ас6чцу ь децгадед Ъу гЬе епдопис1еаае. ТЬе шесЬап)япа оЕ гЬеае геасл)опа аге сошр1ех ап6 аге аипппапге6 !и йе шГоппагюп рапе! оп ВАЕ 3$ лп СЬарсег 13. Рецгас$ал!оп )а аЬао1ше!у берепъ$епг оп йе ргеаепсе оЕ са1сшш, апд йе геас6оп сап йегеЕоге Ье агоррес) ал 6$ГЕегепл яацеа Ьу гЬе аъ)ъ$$$!оп оГ гЬе сЬе!абпц ацепс ЕНОТА. Весасье с)ецгас)ал)оп оссига ге!а6че)у ип)Еогш!у Ггош гЬе гегш)п$ оГ РХА, Йцея$оп ъчКЬ ВАЕ 31 сап Ъе илес) го шар геяпс6оп а!геа $п япа!1 Ггацшепга оГ РХА (Еецега)с! ел а1.
1978). РХА $а с$$цеалес) ъч)гЬ ВА$. 31, апд аашр!еа аге ъч1$Ь6гаъчп ас с)$ГЕегепс гппеа ап6 р1асес1 ш а ао1иг)оп сопгашшц ЕНОТА. АГгег ъ$1цевгюп оЕ лЬеае аашр1еа чбй йе геягк6оп епхуше оГ шгегеаг, геяпс6оп Ггацшепь сап Ъе аееп со ъ$1аарреаг ил а ъ$ецпе<$ огъ1ег. Ву ияпц а РХА сопа)ал)пц оГ чесгог лес)иепсез аг опе гегпппиа (Еог ъчЬкЬ гЬе геяпсбоп гпар )а 1лоъчп) апг$ шппаррес1 аеъ)иепсеа ал йе огЬег, и Ь роаяЫе го 6$аг$пци!аЬ Ггацшепла Ггош йе ичо легпипл апг) го с)еъ)исе гЬе огбег оГ гЬе Егацшепла лп йе ипгпаррес1 РХА. ВА1.
31 сап а1ао Ъе паем го гешоче ипъчапсе6 аеъ)иепсеа Ггош йе сегппп$ оГ РХАа ЬеГоге с1ошпц. Айег ггеалшепг чбй г!ле ехоллис!еаае/елъъ$оллис1еаае, ъ!ле гепшш' оЕ с1ъе РХА аге гераггеъ1 ъч)гЬ ЪасгепорЬаце Т4 РХА ро1ушегаае ог $Ье К)епоъч Егацшепг оГ Е. соц РХА ро1угпегаае 1. цуплЬе6с 1$п)сега аге абс)ед го лЬе РХА, ъчЬкЬ !а $Ьеп Епаеггеъ$ Епго а аи)гаЫе чесгог. Еп йь ъчау, К $а роаяЫе со цепегасе а аел оЕ сне!ел!опт Ггош а с1ецпес$ епс)ро)пг $п РХА. А$$ЬоицЬ йе епхугпе ь ргег$ош)пап!!у а 3' ехопис1еаае, К а!ао Ьаа а РХА епг)опис!еаае асг!ч)гу апс$ с1еачеа !пгегпа11у !п а!пц1е-зггапс1еъ$ гец)опа оЕ РХА ог лп ъ)оиЫе-аггапде6 РХА гЬал сопла)пз Ье1ка1 с$)агогл$опа ЕЬаи апс1 бгау 1979; ъ гау ес а1.
1981; ЪЧе) ег а1. 1983). ВА1. 31 ъч$1! а1ао 6!цел! КХА, а1ЬеК $пеГГгс)епс!у. Е)5Е5 1. Кегпоч)пц пис1еог$6еа Ггош гЬе гегш)п) оЕ ъ$оиЫе-ягапс1ес1 РХА ш а сои!го!!ей плаппег. ТЬе аЬоггепес1 гпо1еси1еа сап Ье иаес) Еол. а чапе!у оЕ ригроаеа аисЬ аа со ргос$исе ъ)е1е6опя го роягюп а с1еягес$ аеъ)иепсе пехл го а ргошогег ог олЬег соплго11шц е!егпепц ог ло аггасЬ ауп$Ьег!с 1лп1сеь аг ъ$еягеъ$ ягеа !и йе РХА. 2.
Марр!пц геалпс6оп ялеа )п РХА (Еецега)с) ег а!. 1978). 3. Марр$пц аесопъ$агу аггисшге 1п РХА, Гог ехашр1е,)ипс6опа Ъегъчееп В-РХА апс1 7.-РХА ог а)геа оЕ соча!епл ог попсоча!епг гпойцса6опа лп доиЫе-ягапъ$ег) РХА (бгау ес а1. 1981; )Ае) ес а!. 1983). 4. Кегпочшц пис!еол!6еа Егопл с)оиЫе-ягапс)ег$ КХА $п ргераппц гесошЬ)пап! КХАа (М)е!е ег а1. 1983). !ХОТЕЛ ° 'ччЬеп йе ргодись оЕ ВА1. 31 г$$цея!оп аге ло Ье 1$цаге<$, К ь ипроггапс со сопядег гЬас йе 3' ехопис)еаае асйбгу оЕ йе епхуше ъчог1ь -20-Го!6 гпоге еЕГлс)епг1у гЬап гЬе РХА епъ$опис!еаае.
ТЬия йе ачегаце!епцй оГ япц1е-алгапдед гаца сгеаъеъ$ Ьу ъ$$цеал)оп оГ!!пеаг ъ)оиЫеаггапс)ес$ РХА ь с)ерепъ$епл оп лЬе епхуше сопсепсгабоп. Ас ЬлцЬ епхуше сопсепсгал)опа Е2-5 ип)гаЕш1), ап ачегаце оЕ Вче пис1еог)г$еа о$ япц1е-ягапъ)е6 РХА гегпагп рег гегпнпсь апъ$10-20% оГ йе шо!еси1еа сап Ье 1)цале6 ло Ыипг-епг)еъ$ РХА ъч!$Ьоиг Еигйег ггеагшепи А! !оъч епгуше сопсепггал!опа (0.1 — 0.2 ип)лйп!), йе япц1е-аггапъ)еъ$ легпиш гпау Ье чегу 1опц апг) йе ейк!епсу оЕ Ыипс-епс)1$цаг)оп Ь чегу!оъч.
Кера!г ъч)й ЬасгепорЬаце Т4 !ЭХА ро!у- А4А4 Аррепг((х 4: Епаутек Ь)кег( т Мо!еси!аг С!опте тесаке (ог, сп коте сакек, сЬе К1епоъч ГгаВтепс) гк а1пюкс оЫсВасогу ЬеГоге с!оп!пц Р)ъ(Ак сгеасегс ъчПЬ еЬЬег Ь!ВЬ ог 1оъч сопсепсгаПопк оЕ ВЛЬ 31. ° ВАЬ 31 ъчог1ск акупсЬгопоик1у„Вепегаг!пВ а роро!агюп оГ Р)ъ(А то1еси1ек ъчЬоке Сегпппг Паче Ьееп гекессег( со чапоик ехсепск апг) ъчЬоке япВ!е-ксгапс(егс сас!к чагу ш 1епцсЬ. РоПоъч(пВ гПВекПоп ъч!(Ь ВА1. 31 апг) герасг ъч!(Ь ЪассегюрЬаВе Т4 РХА ро1успегаке (ог (Ье К1епоъч ГгаВтепс), П Ы оЕсеп тоге еЕЕсс(епс со !ко1асе РХАк оЕ йе гег)шгег) яге Ьу Ве1 е!ессгорЬогеяк га(Ьег сЬап со ксгееп чегу 1агВе пшпЪегк оЕ гапг)от!у Вепегасес) с1опек.
° ВАЬ 31 с!еВгассек АТ-гкЬ кег)иепсек оп!Псапс)у тоге гарнПу йап П гсеВгас)ек СС-псЬ геВ(опк. ТЬик, то!еси1ек йас септпасе сп ЛТ-псЬ геВ(опк аге ипс)еггергекепсегс !п рори1асюпк оЕ Р)ъ)Ак йа(Ьаче Ьееп гс!Вексес( ъчПЬ сЬе епгуте. ° ВА1, 3! кЬои16 пос Ье Егохеп. Йоге сЬе епгугпе ас 4'С. ВАЬ 31 )ъ(0СЬЕАБЕ Ас(М(уг Ехопис!еаке)епбопис(еаке 5иЬкггасег ВА!. 31 беВгадек 6оиЫе-к(сааба 0(ъ(А кег)иеп6а()у Вот Ьой сепп(п!. ТЬе гпесЬап(кт 'ь сЬоиВЬ( со (пчо!че а гар(6 ехопис!ео!у6с деВгада6оп (о!!оъчес1 Ъу а к!оъч епдопис!ео!у6с геас6оп оп 6се сопър!егпепсагу ксгап6. 0оиЫе-к(саида 0)ъ)А ъч)6ъ Ыипс ог рюсги6(пВ ЗсЬудгоху! сеггп(п! аге деВгабед Со кЬог(ег доиЫе-к(сааба гпо!еси(ек. ТЬе епгугпе 'ь а!ко ас6че аС п)с)ък, оп к(пВ!ексгапдед РЫА ъч((Ь 35Ьудгоху! сепп(п), апг! оп доиЫе-ксгап6е6 Р)ъ)А гпо)еси!ек. )СеасИоп Са' (гари геас6оп) Т ВАЬ 31 (2 — 3 ип)гкггп! [ЫВЬ сопсепсгасюп1) 3' 5' 3' С г+ (к!оьч геас6оп) 3' 5' Ыип( епбк ( — 10-20%) к!пВ!е-кггапс е6 Са(!к аЬоиг 5 5' пис!еог)бек !опВ ( — 80 — 90%) 3' 3' ° Мокс сопипегсга1 ргерагаПопк оЕ ВАЬ 31 сопсаш съчо )с!пес!саПу сПкПпсс Гогтк оГ йе епхуте, а Гакс апг( а к)оъч Еопп.
ТЬе к1оъч Еопп гк а ртсео!уск гсеВгагсас!оп ргог)исс оГ йе Еая Еопп. Риге ргерагасюпк оЕ йе Еакс Гопп аге ачаг!аЫе, Ьис йеу аге ехрепяче ( ъгъге! ес а!. 1983). Кеки1ск ик!пВ т(хег) ргерагасюпк ъчП! чагу, г)ерепсПпВ оп сЬе ге1асЫе агпоипск оЕ сЬе съчо Гоппк (п йе списа1 ргерагасюп апг! (Ье гасе оЕ сопчегкюп оЕ сЬе Гак( со йе к1оъч Сопп с)иг!пВ йе аккау.
Ргерагасюпк гкЬ ш йе Гакс Еопп аге ргеЕеггег) Еог кисЬ сак)ск ак гегпоча1 оГ!опВ ()1000 Ьр) кеВтепск Сгопс йе сегпиш оГ с!оиЫе-ксгапг(ег) Р(ъ)А; гсеВгассас!оп оЕ гсоиЫе-ксгапгсег! КХА; апгс тарр!пц оГ геяпсПоп ясек, В-Х РХА )ипсПопк, апг! 1еяопк !п с(оиЫе-ксгапг)ес) Р!ъ(А. ТЬе к1оьч Еопп оГ йе епгуте (к икег) со геточе кЬогс кеВтепск (1Π— 100 Ьр) Егопс (Ье сегппп! оЕ доиЫе-кггапгсег( Р)ъ(А. М)хес) ргерагаПопк оЕ йе епгугпе сап Ье икегс Еог апу оГСЬеке Сак!ск, а!сЬоиВЬ сЬе геки!Гк ъчП! чагу ак тепсюпег! аЬоче. Хис!еаьеь А4.47 Мищ Веаи Ь(ос!еа5е (Мипц Ьеап ьргоиГь) Мипц Ьеап пис!еаье децгат(еь ь(пц1е-ьтгапт)ес) РХА то пюпо- ог о11цопис1еотЫеь чч!$Ь рЬоьрЬасе цгоирь ас тЬеп 5' тепп(ш (1аь)солчь)т)1980). РоиЫе-ьтгапс(ес$ РХА, с)оиЫе-ьтгапт)ет$ КХА, апт$ РХА-КХА ЬуЪт$6ь аге ге1а6че1у геяьтапт то тЬе епгуше.
Ночтечет, <$оиЫе-ьтгапс)ес$ пис!ек асЫь аге с(!цеьтет$ сошр1ете!у Ьу пшпц Ьеап пис!еаье лТ йеу аге ехроьес$ то чету 1агце ашоипо оГ йе епхуше (Кгое1сег ап6 Китча!ь)с! 1978). А1тЬоицЬ пшпц Ъеап пис!еаье апт$ пис1еаье 51 аге япи1аг со еасЬ отЬег ш йе)г рЬуяса1 апт$ сага!утк ргорег6еь, пшпц Ьеап пис1еаье гпау Ье 1еьь ьечете (п пь астюп йап пис1еаье 51. Рог ехашр!е, пис1еаье 51 Ьаь Ьееп ьЬоччп со с1еаче йе РХА ягапс1 оррояте а шс1с ш а т1ир!ех, лчЬегеаь пшпц Ъеап пис!еаье тчП1 оп1у атлас)с тЬе п(с)с аГтег и Ьаь Ьееп еп1агцес$ то а цар ьечега! пис1еотЫеь ш!епцй (Кгое1сег апт$ Колча1ь)т! 1978). Рог ГигтЬег с1етаць, р!еаье ьее тЬе !п(огпта6оп рапе! оп МЕЛХС ВЕАХ ХЕЛСЕЕА5Е ш СЬартег 7. $)5Е5 $.
Сопчегбпц рготгис((пц теппшт оГ РХА то Ыипс епс)ь. 2. Апа1усбпц тЬе ьтплстиге оГ РХА-КХА ЬуЬт(6ь. Ехоиос!еаье П! (Е. со$$) Вхопис1еаье 1П саса!ухеь йе ьтерлч!ье тегпоча1 оГ 5' тпопопис!еотЫеь Гготп тЬе 3'-Ьус)тоху! теттпшт оГ т(оиЫе-ьтгапде6 РХА (ЪЫьь 1976). 1!пеаг т(оиЫе-ьтгапс(ет( РХА апт( с(гси1аг РХАь соптатшпц п(с)сь ог царь аге ьиЪьтгатеь.
ТЬе аст(ч(ту оГ йе епгуше геьи1ть 1п йе Готша6оп оГ 1опц ь!пц1е-ьтгапс)ес$ гец(опь !и доиЫе-ьтгапт)ет$ РХА. ТЬе ептуше а!ьо сагпеь ГЬгее отЬег аст!ч!т!еь: ап епт)опис!еаье ьрес!Пс Гот ариппк РХА, ап КХаье Н ас6чиу (Коцегь апс) Чте(ьь 1980), апс( а 3' рЬоьрЬатаье асбиту, лчЬ!сЬ тегпочеь 3'-рЬоьрЬате сегпиш Ъ|лт т$оеь пот с1еаче лптегпа1 рЬоьрЬосиеьтсг Ьопт)ь. ТЬе ехопис!еаье мл11 пот децгас1е ь(пц1е-ьтгапс(ет( РХА ог с)оиЫе-ьтгапт)ет$ РХА чч!тЬ а рготгисипц 3' тепшпиь (Коцегь апт$ рте!ьь 1980).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
