Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.3 (522944), страница 131
Текст из файла (страница 131)
Кеасрюопг 0е8гаг1апоп о1 аиЪПга)еа нчГЪ 1 ее епдр у!е!д)п8 пЬопис!еодде ргодис)ь ГЪаГ аге 4-20 пис!еоГ)доя )и !еп8гЪ апд соп)а(п 5 -РЪокрЪаге апд 3'-Ъуг!гоху! геггп!п!. КХ)А а ... Г) С С С 0 Л~ > а' 1.) Сг р р р р генегъе Ггаласпргюе ' ' ' р р 0)чА г...АрСРСРСРАрТР А С СРСРА та С С 0 Аз РМА Ро)утегаьеь А4.25 сРМАь сотр1етепсагу со 1оп8 гпИЯАь. Ас йе Ье8)пп)п8 оЕ сЬе геас6оп, йе ЬуЪгЫь Еогтег) Ъес|чееп йе рпгпег апг) йе сетр1асе тВЬСА аге ьиЪьсгасеь Еог КЬ)аье Н. ТЬы, ас йе Ье8)пи!и8 оЕ сР)ь)А ьупсЬеяь, йеге В а со|пре66оп Ъеслчееп г)е8гадассоп оЕ йе сетр1асе тВЬСА ап|1 |п|6асюп оЕ РМА ьупйеяь !Вег8ег ес а1. 1983).
1п асЫ)с)оп, КЬ)аье Н сап жеане сЬе сетр1асе пеаг йе 3' сегиипиь оЕ сЬе цголч)и8 РХА ьсгапг) !Е гечегье сгапьспрсаье раиьеь ссипп8 ьупйеяь (Когелч)сг е| а1. 1988). !и сопьег)иепсе, СЬе ЫВЬ 1ече1 оЕ КХаье Н асг)ч)гу |и ргерагасюпь оЕ |Ье ач)ап епгуи|е Сепг)ь со ьирргеьь йе у)е16 оЕ сРМА ап|1 Со геьСпсС Вь!епВСЬ. ° ТЬе ач|ап епгуте ъчог)сь еЕ6с)епс1у ас 42"С !|Ье попиа1 Ъо|1у сегпрегашге оЕ сЫс1|епь), лчЬегеаь |Ье ъч!1с1-суре ишппе епгуте В гарЫ!у шасс)насел) ас сЬВ сетрегасиге.
КЬСАь псЬ )и ьесопг)агу ьсгиссиге аге йегеЕоге сор)е|1 п|оге еЕ6с|епс1у Ъу сЬе ач)ап епгуте |Ьап Ьу йе ишппе епгуте. Нолчечег, ргерагасюпь оЕ йе ач)ап епгуп|е сап Ье сопсат)пасед Ьу ап епдопис1еаье |Ьас с1еанеь РЬ!А. ТЬ|ыь по|ч 1ея оЕ а ргоЫет йап Ь лчаь ш сЬе еаг!у 1980ь, |чЬеп сР!4А 1|Ьгапеь Веиегасес) лчссЬ соп|рагас)че1у пироге ргерага6опь оЕ сЬе ач)ап епгуи|е ье1дот ехсеег)ег) 1 1|Ъ ш!епВСЬ. ° ТЬе ачсап епгуте |ногль тоге ербссепс!у ас рН 8З сЬап ас рН 7.6, сЬе рН ргеЕеггег) Ьу сЬе ишппе епгугпе. ТЬе 1еп8|Ь оЕ сЬе сРХА ьупсЬеягел) Ьу еиЬег епгуте )ь 8геас1у гег) исес) |чЬеп геассюпь аге сагпес! ош ас а рН йас йЕЕегь 6от сЬе орспишп Ьу аь 1!В1е аь 0.2 пи|и Япсе СЬе рН оЕ Тпь сЬап8еь лч)сЬ сеи|рега|иге, Ь В еььепгса1 Со сЬес)с йа| йе рН оЕ йе геасСюп пах|иге сь соггесс ас йе сетрегасиге сЬоьеп Еог |псиЪасюп.
рог гпоге шЕопиа6оп, р!еаье ьее сЬе шЕоппасюп рапе! оп Мо-МСч' ССЕчЕК5Е Тййй5С|С1р|А5Е !и СЬарсег 11. 1)5Е5 1. Кечегье сгапьспрсаье )ь пьем сЫебу со сгапьспЬе тКХА 1псо доиЫе-ьсгапг)е|1 сРЫА |Ьас сап Ье !пьес|а шсо рго)сагуоск чессогь. Нолчечег, гечегье сгапьспрсаье сап аЬо Ъе пьес) лчссЬ еЬЬег яп81е-ьсгапг)ег) Р)4А ог КХА сеп|р1асеь со гпа)се ргоЬеь Еог ые )и ЬуЬгЫ|га6оп ехрегпиепсь. ТЬгее суреь оЕ рптегь аге иьег) |и сЬеье геассюпь: ° О11до(йТ)лгл. |чЬ|сЬ Ъспс)ь со йе ро1у(А) сгасс ас йе 3' сеппшы оЕ |иаиииа!!ап тлсМАь ап|1 рптеь йе ьупйеяь оЕ сЬе 6гя ьсгапг) оЕ сРМА.
Ререпйп8 оп сЬе срла1иу оЕ сЬе гечегье сгапьспрсаье ап|1 сЬе геассюп сопй6опь, сЬе ье|1иепсеь ас йе 3' сегиипы оЕ йе сеи|р!асе тау Ье очеггергеьепсег) )и |Ье сР! 1А. ° О1цопис1еог1|Ееь оу гапйот ьедиепсе (Тау1ог ес а1. 1976). ТЬе аип )ь со иье а рори1а6оп оЕ о118опис1еосЫеычЬоье ье|1иепсе йчегясу |ь ьо!аг8е йас ас 1еая ьои|е )п|1|чЫиа1 о68опис1еосЫеь лч)1! аппеа1 со йе гетр!асе апс) ьегче аь рптегь Еог гечегье сгаыспрсазе. Весаые йЕЕегепс о1|8опис1еосЫеь Ь~п|1 со йсуегепс ьег!иепсеь, а 1аг8е ргорог6оп оЕ |Ье ьес)иепсеь оЕ йе сегпр!асе лч111 Ье сорсег) Ъу йе епгуи|е, апг) !Е а1! оЕ йе рптегь аге ргеьепс ас е|)иа1 сопсепсга6опь, а11 ьег)иепсеь оЕ йе сетр1асе ьЬои!д Ье сор)ег) ас ег)сла! Егес)иепс)еь. 0118опис1еосЫеь оЕ гапдот ьес)иепсе сап Ье ьупсЬеягес) оп ап аисотасег) РМА ьуп|Ьеыгег ог сап Ье Вепегагег) Ьу Ьус)го!уяь оЕ Ь!ВЬ-то!ессс1аг-лче18ЬС Р)ь)А.
° О118опис)еог1г)еь о~йефпегЕ ьег)иепсе. 01!цопис1еоСЫеь оЕ г)еЕлпег) ьес)иепсе сап Ье пьес) со ргипе йе ьуп|Ьеяь оЕ сРМА соггеьропйи8 со а рагски1аг тКХА. Весаые |Ье пе|ч!у ьупсЬеыгес) РХА )ь сотр1етепсагу со йе ьег)иепсеь оЕ йе тКЬ)А йас!)е ирьсгеат оЕ йе ргипег, сЬыпесЬод (рг)тег ехсепяоп) ргочЫеь ап ассигасе теаялгеи|еис оЕ йе йьсапсе Ьес|чееп а Елхес) ро|пс оп ап тВЬСА аи|1 )сь 5' сеппишь. 2.
ЬаЪе1)п8 йе сепшп) оЕ РМА Ега8тепсычиЬ ргосгийи8 5' сегииш !Е|11ш8 геассюп). ' ТТТТТТТТТ ххаааа ° А4.26 Аррепт))х 4: Епзутет Етвес) пг Мо1еси1ат С1опгп~ 3. ТЬе епгутпе сап а!зо Ъе иве!1 то зет!иепсе 13ХА5 Ьу ТЬе ййеоху сЬа!и тегпипатюп шегЬот! (5апВет ет а!. 1977) туЬеп огЬег еплушез (е.а., гЬе К1епотч гтаВшепг ог 5ес)иепазе) у)е!д ипзаг)згасгогу геаи1гя )ЧОТЕ5 ° Вечегзе тгапзспрсазе 1ас115 3' — э5' ехопис!еазе асттч)гу, ччЬ)СЬ асгз аз ап ей!!па типсгюп тп Е.
со11 )3ЫА ро1ушегазе 1, апт) 15 йеге)оге ргопе го еггог. 1п гЬе ргезепсе от Ь)аЬ сопсепсгагюпз от Й)4ТР5 апс) Мпзе, -1 Ьазе ш ечегу 500 ып)5!псогрогатет). ° Весаизе ТЬе К ог течетзе тгапзспртазе гог Ьз т)1 !ТР зиЬягатез 15 чету Ь!цЬ вЂ” тп тЬе ппПипо1аг гапае — Ь 15 еыепПа! со !пс!ит)е Ь!аЬ сопсептгагюпз ог' т)ХТР5 !п тЬ15 геасВоп то ргечепт ргешатиге тегпипаВоп от" петч1у зуптЬеяхед Е)Ь)А сЬа!пз. ° Вечегзе сгапзспргазе сап Ъе изет) го зупйеяхе япа!е-згтапс)ет) соргез от Е)Ь)А тешр1асез из!па ОПаопис1еогЫе рпшегз (р!еазе зее Р)аиге А4-3, рагс А). Ноъчечег, ЬогЬ т!Оиые-зтгапс)ет! ап11 япВ1е-зтгапт)ет1 СТ)1МА5 аге аепегатес) тгош ВХА Гешр1атез 1Р1еазе зее Р)сиге А4-3, раут В). Ве!т-рт)гпес! зупгЬеяз 15 пшсЬ )еаа еуйс!епг гЬап зупгЬеяз тгош т!те асЫет! ОПаопис1еотЫе ргипегз.
ТЬеге1оге, зе! !'-соптр! етпептагу Ьа)трш пю1еси1ез изиаПу сопзПтите оп! у а япаП )тасГюп оу ГЬе зуптЬез!хет) с!ООЫе-в!таит!ет! С13Ь!А 15ее СЬаргег 11). 1г песеяагу, Ъой зе1т-рт)шет) апд ехоцепои51у ргппес1 зесоп11-зтгап11 зуптЬеяз сап Ье !ОЬ!Ь)тес! Ьу шс1исПпц асПпотпустп Е) !и йе геасПоп пихтиге ас а Впа1 сопсепггатюп от 50 )тайп!. 5' огропсс1ео!гбе ОМА рпппег епрге-вггапбеб ОМА 1еярга!е бАТР бСТР битр бТТР пегг!у вуптпемаеб ОмА 5' агв! Мгапб СОМА з 5' огцопсг1ео1гбе ОМА рг!ппег ПМА гепгр1аге з Ппаве Н ог !пс!баеб бу асвпояубп О ве!1-рппгеб вуптева о1весопб вггапб аесопб оаропсс1еоабе рпппег Е)С1) КЕ А4-3 1)ве о1 Вечетве Тгапвспртаве Го Сепегаге РгоЬев 1тош 0)МА (А) апт) В)МА !В) Тешр1атев О)чА Ро!утегаьез А4.27 Теггп!па! Тгап5тега5е (Тегпппа! Оеохупос!ео(!ду! Тгап5тега5е) (Са!( !Ьушиа) Тегпппа1 ггапьуегаае (М, = 60,000) Ы ап ипцаиа1 0ХА ро1угпегаае Гоипг! оп1у !п рге!ушрЬосугеа !и еаг!у па8еа оу 1утпрЬоЫ й(гегепг!аг!оп (СЬап8 апс1 ВоПшп 1986):1п йе ргеьепсе ог а йча1еп! сапоп, йе риНВес1 епгуше сага1угеа йе агЫ!Поп ог" гПх)ТРя го гЬе 3'-Ьус1гоху! гегппш о( 0)х)А гпо1еси1еа (ВоПшп 1974).
ЪчЬеп гЬе пис1еогЫе со Ье асЫег! 15 а риг!пе, Мф+ ь гЬе рге- (еггеП сапоп; хчЬеп йе пис1еогЫе Ы а ругциЫше, Соа" !а избег) шягеас1. ТЬе пипцпшп сЬа!п 1еп8гЬ оу гЬе ассергог 0)х)А Ы (Ьгее дХТРя, апд аа шапу аь зечега! гЬоиаапд ЛИТРАМ сап Ье !псогрогагед 1Т йе гапо о1 ассерсог со пис1еогЫе !а аг()цагеП соггесг1у. 5!п81е пис! еогЫеь сап Ье асЫег! го йе 3' гегпцп! о( РХА !г' шой()ей пис!еогЫеа (е.8., г(Паря ог согг(усер1п гг!РЬоарЬасе) аге избег) ая гиЪяггагеа.
Ногпоро1угпега оу г)х)ТРя сап а)ао Ъе ьупгЬеа!гег( ас гЬе 3' сегш!п! о( 0ЫА шо1еси!еа ш йе ргеяепсе оу Сои ((ог геуегепсеь, р1еаье атее СЬап8 апг( ВоПшп !986). ТЬе епгугпе аггои81у ргеуегь го цае 0ХАа хчЬЬ ргоггийп8 3' сегпцш' аь ассергогя. Ноччечег, Ыипг ог гесеааед 3' сегш!п! аге цаес), а!Ьеп 1еаа ейк!еиг1у, ш ЬигТегь ог!охч юпк пгеп8й гЬаг сопса!п Со~~ ог Мп2+ (КоусЬоиг(Ьигу ег а!.
1976; Хе1ьоп апс) Вгиг1а8 1979; КоусЬоиг)Ьцгу аиг! Юи ! 980; М!сЬе1аоп апд ОгЫп !982; Реп8 апс1 чЧц !983). Рог ЕиггЬег !и(огшаг!оп, р1еаае атее гЬе )пгогшапоп ране! оп ТЕКМ!ЫАЕ ТКАб!5ЕЕКА5Е ш СЬарГег 8. с)5Е5 1. АгЫЬюп оу сошр1ешепгагу Ьогпоро1ушегк га(15 го чесгог апг) с0)х)А. 2. 1.аЪе!ш8 йе 3' гегпцш' ог 0)х)А Гга8шепГя хч1ГЬ а пр-!аЪе1ед гПх)ТР (Ти апд СоЬеп !980), а гЫ)Х)ТР (СоггагеП! ег а!.
!969), ог ап г)х)ТР (ччи ег а1. ! 976). Рог 1аЬе1ш8 хч!ГЬ гара, (а-пр]гЕ4ТР Ы цаег( !и гЬе ргеаепсе ог Со2ч, гоПоюес( Ьу ггеагшепг хч!(Ь аПгаП (р1еаае атее ГЬе рапе1 оп ТЕКМ!(х!АЕ ТКА!ч!5ГЕКА5Е Ъе1очч). ТЕКМПх!АЕ ТКА)х)5ЕЕКАВЕ АсГ!чау: Тепп!па! !сапа(егаяе 5ибгггаге: 5!п8!е-ьГгапдег! 0гчА чч!гЬ а 3'-Ьу8гоху! сегш!пич ог доиЫе-аггапдег) О!4А чч!гЬ а ргоггиг)!п8 3'- Ьуг!гоху! геггп!пиа 'ь рге(еггед, В!ипг-епдег), доиЫе-ьггапг)ег! 0ЫА ог О!х!А ъч!КЬ а гесеяьед 3'- Ьуг)гоху! Геггп!пца яегчеа ач а !егор!аГе К Со~+ ь вирр!!ег! ач а со(асгог (КоусЬоиг)Ьигу ег а!.
1976; (4е!хоп апд Вш8а8 1979; КоусЬоибЬигу апс$ !Мз 1980; М!сЬе!хоп апд Ог)а!и 1982; 0еп8 апс! ЪМз 1983). Кеасгюп; а!п8!е-яГгап8сх) 0Г!А Мп~* ог МВг+ г)АТР дТТР ЙСТР дСТР А4.28 Арреисцх 4: Еигутет $7тет$ тп Мо!еси)аг С!отпц 0МА-РЕРЕМРЕМТ ВМА РО$ТМЕВАЬЕБ ВасГепор$заде 6Р6 аос$ ВасГепор$таде5 Т7 аое$ ТЗ ЙХА Ро!уозега5е5 !ВасгепорЬаде 5Р6-1пГес$ет$5а)шопе!!а ГурЬ)тиг)ит П 2 апт$ Ьасгег)орЬаце Т7- ог ТЗ-$пГесгет$ Е. со6) ВастепорЬаце 5Р6 зуптЬеятеа а РХА-т)ерепс)епт КХА ро1ушегаае тЬас гесоцп)хек апт1 !п)т)атея яуптЬеяа оГ КХА оп т)оиЫе-атгапс)ес) РХЛ тешр1атет саггу)пц тЬе арргорпате ЬассепорЬацеьрес)6с рготпосег. ТЬе ро1ушегазе В итет$ тп н)тго со цепегате 1агце т)иапт)т)еа оГ КХА сошр!ешептагу со опе ттгапс) оГ Гоге)цп РХА йат Ьаа Ьееп р1асет$ ипшесцате!у т)отнпатгеаш 1гопт йе рготпотег.
Честить саггутпц тЬе ргошотег аге ачат1аЫе то вуптЬеяте КХА сошр!етпептагу то е)йег аггапт) оГ тЬе тетпр1асе Ъу сЬапц)пц йе опептатюп оГ йе рготпосег тч)тЬ геьрест то тЬе с!опет1 Гоге)цп РХА ает)иепсеа (Вш1ег апс1 СЬашЪегбп 1982; Ме1топ ет а1. 1984). А1тегпаоче1у, тЬе рготпотег сап Ъе атЫес1 со йе тагцет РХА с$иппц РСК рг)шет) Ьу обцопис1еотЫеь ет)и)ррес) нбгЬ а сопсепаиа ргошотег !р!еахе аее СЬарсег 9, Рготосо! 6). ВастепорЬацеа Т7 апт) ТЗ а1тю ьупйеяхе РХА-т)ерепт)епс КХА ро1ушегааеа тЬас гесоцп)хе апт1 тпгбате ауптЬеяь оГ КХА оп т)оиЫе-ытгапт)ет) РХА тетпр1атеа йат саггу тЬе арргорпате ЬастегюрЬаце-арест16тс ргопютег $Гог ГигтЬег т)ета)1я р1еаае аее тЬе 1пГогшат)оп рапе1 оп ттКО$чтОТ- ЕК 5Ет1$)ЕХСЕ5 КЕСОСХ$ХЕ0 ВУ ВАСТЕК$ОРНАСЕ-ЕХСООЕ0 КХА РОЕЧМЕКЛ5Е5 1п СЬартег 7). ТЬеае ро1ушегааеа аге пает) тп чаго )иат 6)се йе ЪассепорЬаце 5Р6 КХА ро1ушегаье.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
