Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 64
Текст из файла (страница 64)
ТЬе па|иге оЕ |Ьеге соп(оггпа1юпа! сЬапеех 13 оп[сполна, ах $5 йе гпесЬапВгп Ьу ъчЫсЬ тгапх|осаПоп о( 1Ье цгочдпц сЬа|п оссигх ат еасЬ ге|тегатюп оЕ йе ро$угпеихаПоп 5|ер. (Ат|артет|, ил|Ь реггп)53)оп, (гоги Веехе ет а|. 1993а [СорупВЬ( 1993 Агпег|сап АЗ«ос!а![оп Еог ЕЬе Адчапсегиепт о( 5с|епсе!.) Еи]огтаХоп РапеЬ 9.85 1Е а [«з5]йХТР ыьей пьсеай оЕ йе сопчепдопа! [а «|Р]йХТР |Ье геасдоп 6 1|шве|1 со опе сус1е оЕ геточа! апй гер1асетепс япсе |Ье 3'-«5' ехопис1еазе оЕ Е. со6 РХА Ро! 1, ип6)се сЬе ехопис1еазе оЕ Т4 РХА ро!утегазе, саппос ассас1| сЬ~оезсег Ьопйз (Кип1|е1 ес а!. 1981; бирса ес а!. 1984).
ЕаЬе!Елд 5(лд!е-з(галгЕегЕ О%А Ьу Кал|Еолг Рг(лг!ле Рог йеса|1з, р!еазе зее РешЬег8 апй ЪЪВе1зсе(п (1983, 1984) апй Ргососо1з 1 апй 2. Ргогуисг(ол оЕ 5(лфе-зггалгуегЕ РгоЬез Ьу Рг(тег Ехуелз(ол Рог дега|!з, р1еазе зее Меш1|осЬ апй '«««аЫ (1984), 5сийепсЫ ап|1 ««га!!асе (1984), апй СЬарсег 7, Ргососо! 12. Рог |папу уеагз, сЬе К!епо|ч Йа8шепс оЕ Ро! 1 |чаз сЬе Ь!8Ьезс-с)иабсу РХА ро!уп|егазе сЬас «чаз соттегс|а!1у ача|! аЫе апй, |и сопзес)иепсе, «чаз йе епхуте оЕ 6гзс апй!ая гезогс Еог |и чнго зупйеяз оЕ РХА.
Но«чечег, аз ро!угпегазез сЬас аге Ьессег зиней со чапо|о зупсЬеис саз[сз Ьаче Ьееп сбзсочегей ог еп81- пеегей, К1епо|ч Ьаз Ьееп Вгайиа!!у гер1асей апй ь по 1оп8ег сЬе епхуте оЕ 6гьс сЬоке Еог а чапесу оЕ ргоседыез |и то!еси!аг с!ошп8. ТЬезе ргосейигез шс!иде: ° РХА зедиепс!и8 Ьу гЕ|е 5аи8ег тег]год. К!епо|ч Ьаз Ьееп гер!асей Ьу ЬассепорЬа8е ог йеппозсаЫе ро1угпегазез |Ьас 8|че 1оп8ег геай-!еп8сЬз. ° Буигйеьо ос доиЫе-ьлаидед РХА Егот зт81е-ьггапдед гетр!всеь диг(и8 |и зйсго тигаееиез(чх А!сЬоиВЬ |Ье К!епо«ч Ега8тепс ь з611 «ч!де!у изей Еог |и ч|сго зупсЬеяз оЕ с(гси!аг РХАз ияп8 гписаВепк рп|пегз, |с ь пос аЬчауз сЬе Ьезс епхуте Еог й|з ригрозе.
Уп!е|ь!аг8е «)иапс(с(ез оЕ!!Вазе аге ргезепс ]п йе ро!угпепхайоп!ехсепяоп геасйоп пвхшге, йе К!епо|ч епхуте сав с]ьр!асе йе вшса8ешс о1!Волос)еос!йе ргипег Его|п сЬе сев|р!асе зсгапй, йегеЬу гейис|п8 йе пшпЬег оЕ пшсапсз оЬсашей. ТЫз ргоЫет сап Ье зо!чей Ьу изш8 РХА ро1ув|егазез сЬа| аге ипаЫе со саггу ош зсгапй сбзр1асетепс, |пс! исбп8 ЬассепорЬа8е Т4 РХА ро!уп|егазе (Хозза] 1974; ЬесЬпег ес а1. 1983; Се|еье!зодег ес а1. 1987), ЬассепорЬа8е Т7 РХА ро!у|пегазе (ВеЪепе[с апй Кип)се! 1989), апй 5ег)иепазе (5сЬепа 1989).
ВассепорЬа8е Т4 Веве 32 ргосеш (а яп8!е-зсгапйей РХА-Ь|пд!п8 ргосеш) сап Ье гьед ш ргипегехсепяов геасйопз саса1ухед Ьу РХА ро!уп|егазез (шс1ий!08 йе К!епо|ч епхуте) со а1!еч!асе зса11ш8 ргоЫеп|з сасье|1 Ьу сегпр!асез псЬ (п зесопйагу ягиссиге (Сга![с ес а1. 1985; Кип1|е! ес а!. 1987).
° ро1утегазе сЬтп геасооиз. ТЬе К!епо|ч Ега8тепс |чаз сЬе епхуте изей |и |Ье Йгзс ро1утегаье сЬаш геассюпз (5а1Ы ес а1. 1985). Но|чечег, и Ьаз по|ч Ьееп сотр!есе!у гер!асе|1 Ьу |ЬеппояаЫе РХА ро!утегазез йас пеей пос Ье гер!епьЬей айег еасЬ гоипй оЕ зупйеяз апй йепасигасюп. Гас!з алд Е]вогез АЬои! !Ье К!епочч Ггаеглел! ТЬе ыапдаг|1 аыау |лед со спеаз иге сЬе ро1утегазе асйчбу оЕ сЬе К)епосч Ега8тепс [з сЬас оЕ 5едо|ч (1974) |чвЬ ро1у(й[А-Т]) аз сегпр!асе.
Опе ишс оЕ ро!уп|епгйп8 асс!ч(су ь сЬе ап|оипс оЕ епхуте сЬас саса!улез сЬе (псогрогапоп оЕ 3.3 пспо1ез оЕ ВХТР шсо асЫ-шзо!иЫе в|а|ела! и 10 пвпшеь ас 37'С. А за|пр1е оЕ риге К! епо|ч Ега8тепс Ьаз а зрес(6с асйчпу оЕ -10,000 ип!сзйп8 ргосеш (Ре|ЬузЬ|ге ес а1. 1993). ТЬе геассюп ь изиа11у сагпей ош ш сЬе ргезепсе оЕ М8|'. 5иЬзспийоп оЕ Мв'ч Еог МВ|' |псгеазез сЬе гасе оЕ |пЬ- шсогрогасюп апй йесгеазез сЬе ассигасу оЕ ргооЕгеасбп8 (Сагго!! апй Веп)сочк 1990).
ТЬе К оЕ сЬе епау|пе Еог сЬе соиг йХТРз чапез Ьепчееп 4 апй 20 Сгм. Рог |пе|Ьойз со атау сЬе ехопис!еазе асдч|су оЕ йе К1епо|ч Йа8шепс, р!еазе зее Ргеегпопс ес а1. (1986) апд РегЬуз1иге ес а1. (1988). !)зез оЕ Ро1 1 |и 840!еси!аг С]оп[ли ° йа(«е1!ад оЕРХА Ьу и!с]г лапь!аоои (Мап(ас[з ес а1. 1975; К[8Ьу ес а1.
1977). 1п Й|з геассюп, Йе епхуте Ь|пйз со а пк)с ог зЬоп Вар ш йир!ех РХА. ТЬе 5' — «3' ехопис!еазе асйчву оЕ Ро1 1 сЬеп геточез пис!еосЫез Егот опе агап|1 оЕ|Ье РХА, сгеапп8 а сев|р!асе Еог яв|и!сапеось зупйеяз о(йе Вгоч щВ зсгапй оЕ РХА. ТЬе оп86па! и!с]с ь йеге(оге сгапз!асей а! оп8 йе РХА то!еси1е Ьу сЬе сотЬшей ассюп оЕ |Ье 5' — «3' ехопис1еазе апй сЬе 5'-«3' ро1утегазе. 1п Р(8иге 9-8, йе п к[с ш йе иррег зсгапй оЕ дар!ех РХА Ь сгапз1асей Егогп 1е6 со пВЬс ап|1 йе рассЬ оЕ пеъч!у зупсЬеяхей РХА Ь гергезепсей Ьу сЬе зЬа|1- ей агго«ч.
Х(с)с-сгапз1ас(оп геасйопз аге изиа11у сагпей ош ас 16'С со гедисе йе зушЬеяз оЕ "зпар- Еп(огтабоп РапеЬ 9.87 $$Ь$ 'ъу$ТКО ТКА(Ь)вСР! РТЕО)Ь$ БУЬТЕМв ТАВЕЕ 9-4 РгопсоСег 5егсиепсея КесоКп!гед Ьу ВасСепорЬаВе-епсодед КХА Ро1ушегаяея Раомотса ВАстсасорнАсс — 15 — 10 — 5 +1 +5 ТААТАССАСТСАСТАТА666А6А Т7 ААТТААСССТСАСТААА666А6А АТТТА66 6АСАСТАТАСАА6 Т 6 ТЗ 5Р6 ТЬе сотепяпа аеапепсеа оГ ргопгогега аге гесояпггед Ьу йгес ЬассепорЬаяе-епсодед РХА ро1ушегаяеи Т7 Еяппп апй яспйег 19831, ТЗ ( р 1. Весх ег а1. 19891, апй 5ря (Вгопп ес а1.
19861. АП оГ йе ЬасгегюрЬаяе ргошосега йаге а соге яеапепсе йас ехгепда сгош -7 го ес, ъп88еъсш8 йас йь героп Ьая а сопппоп го!с ш ргопъогег Гопсдоп. ТЬе ргопюсегя дйегяе 1п йе ге81оп сгош — 8 со — 12, яп88еапп8 сЬас ргопъосег ъресгбс сошасп аге гпаде ш йИ сея!оп. Ву сопчепсюп, сЬе аеппепсе оГ йе попюгпр1асе аггапд и аЬочгп.
(Адар!ей ъегсЬ регппьюп, Ггогп !огяепяеп ес ас. ! 991.1 Н(гсиаПу аП ш чссго сгапяспрпоп оЕ РХА шсо КХА Ь сагпес$ оис чпсЬ ЪассепорЬа8е-епсос1ей РХА- дерепйепс КХА ро1угпегаяея. ТЬе ча1ие оЕ ияп8 Ьассег!орЬа8е-епсойед РХА-дерепйепс КХА ро1угпегаяея апяея Ьесаияе йеяе епгушея (1) шК)асе еЕ6ссепс апй яе1ессв е сгапяспрсюп Егопс ъчеП-де6пед со8- пасе ргогпосегя (Ме!соп ес а!. 1984) апй (2) Ьеш8 согпрояей оЕ а яп81е ро!урерсЫе сЬаш (-900 апипо асЫя), пеед по аихл!сагу сгапяспрсюп Еассогя, регЬаря Ьесаияе сЬеу Ьаъе ечоХей со сгапяспЬе а япаП вшпЪег оЕ Вепея сп а ярес(а!пей цепогпе ъч!й ЫВЬ еЕЕсс(епсу.
ТЬе Ьеяс-сЬагассепгей ЬассепорЬа8е КХА ро!ушегаяея аге йояе епсодей Ьу йе 5а1топеПа сур)ггтиггит ЬассепорЬа8е, 5Р6 (Вис1ег апс1 СЬагпЬегПп 1982; Сгееп ес а!. 1983), апд йе Е. соП РЬа8ес, ТЗ апй Т7 (5сид(ег апй КояепЬег8 1981; Рачап!оо ес а!. 1984; ТаЬог апд рйсЬагйяоп 1985). ТЬе Вепея епсосПп8 сЬеяе сЬгее КХА ро!угпегаяея Ьаче Ьееп Ьо!асес1 (Рачап!оо ес а!. 1984; Моггь ес а1. !986), яегрлепсед (МоЕЕасс ес а1.
1984; МсСгаю ес а1. 1985: Косаш ес а!. 1987), апс1 ехргесьес1 (Рачап1оо ес а1. $984; Моггь ес а!. 1986). 1п сЬе саяе оЕ сЬе Т7 ро1успегаяе, сЬе сгуяса! япксиге оЕ йе епгуше Ьая Ьееп е!исЫасес1 (РоиЫ(е ес а1. 1998). ТЬе 5Р6, ТЗ, апс$ Т7 РХА-дерепйепс КХА ро!упсегаяея ЬеЬаче ш а япи1аг ЕаяЬ- юп, апй сЬеге аге по йьсшсс ЬсосЬепдса! айчапса8ея со ияп8 опе КХА ро!угпегаяе очег сЬе осЬег. ТЬе 5Р6 епгугпе ь суркаПу Еоиг со Пче сипея споге ехрепяче сЬап йе Т7- апй ТЗ-епсойед епгугпея, ечеп сЬоиВЬ П ь сЬе еаяеяс оЕ сЬе сЬгее со ргераге Егосп ЬассепорЬа8е-сп(ессес$ сеПя. А1сЬоиВЬ аП йгее КХА ро!угпегаяея Ьаче йе аЬ(1иу со сгапяспЬе яп81е-ясгапс(ей РХА (5а1чо ес а1.
1973; МППВап ес а!. 1987), ч(гсиаПу аП ш чссго сгапяспрпоп ь сагпед ош ъчиЬ доиЫе-ясгапйед !шеаг РХА сешр!асея сЬас сопса(п ап арргорпасе ргопюсег (р!еаяе яее ТаЫе 9-4). 5шсе сЬе пипипа1 ргопюсег Еог ЬассегюрЬа8е КХА ро1угпегаяея ь !ияс 21 Ьр ш 1епВй ()ог8епяеп ес а1. 1991), рогсаЫе ЬассегюрЬа8е ргопюсегя сап еая!у Ье тапи(ассигег$ Егогп яупйеис оПВопис1еос(дея.
РоиЫе-ясгапс)ед РХА 1шКегя сопсасшп8 а ЪассегюрЬа8е КХА ро1угпегаяе ргогпосег сап а1яо Ье 68асей сПгесс1у со рип6ей РХА Ега8гпепь (1.оеъчу ес а1. 1989) ог РСК ргосЪлсь. Ву яупйеягш8 йе арргорпасе 1ш)сег(адар!ос, опе Ега8шепс оис оЕ а пихсиге сап Ье пюс66ей авс1 яиЬяесрлепс1у сгапяспЬед сп Ысго. Зупйеск ргогпосегя сап а!яо Ье асЫед со сЬе 5' епгЬ оЕ ргипегя сьей со ашрНу РХА Ьу РСК (р1еаяе яее СЬе рапе! оп А001Т!ОХАЕ РКОТОСО(и С)51ХС РСК ТО АРР РКОМОТЕК5 ГОК ВАСТЕК1ОРНАСЕЕХСОРЕР КХА РО$Л'МЕКА5Е5 ТО ГКАСМЕХТ5 ОГ РХА ш Ргососо! 6). Еяяеп6аПу апу ЕуХА пю!еси1е сап йегеЕоге Ье ашр66ей чдсЬ а ЬассепорЬа8е ргопюсег ас ове ог Ьой епдя оЕ сЬе гпо1еси1е.
ТЬе агпрППес1 РХА Ь ап еЕПссепс сеспр!асе Еог ш Ысго сгапяспрдоп геассюпя. РСК сап аЬо Ье сьес1 со 1псгосЬлсе сопчешепс геяспсдоп ясея ас йе епс1 оЕ йе РХА со Еасс!ссасе 1шеапгадоп оЕ сешр!асея апд со !псгосЬлсе сгапя1асюп я8па!я ас сЬе 5' епс1 оЕ а РХА Ега8шепс со аПоъч сЬе КХА ргос1исс со Ье сгапя!асес$ е(6ссевс!усп сеПЕгее ргосеш-яупсЬея(гш8 яуясепь (Вгоъчпш8 1989; Каш ес а!. 1991; р!еаяе яее СЬарсег 17). ТЬе аЕПпКсея оЕ сЬе ЬассегюрЬа8е ро!ушегаяея Еог сЬегг ргогпосегя аге гасЬег 1оъч (-10 7 м '), апс1 пис!еояйе спрЬоярЬасея аге гес!шгед со ясаЬ11Ье сгапяепс ргопюсег!епгуше сошр!ехея.
Айег а яЬогс 1а8 репод, КХА яупсЬеяя гарЫ!у геасЬея а гасе (Еог Т7 апд ТЗ ро1ушегаяея) оЕ 200 — 300 пис!еосЫеяьесопй ас 37 С, а1гпояс сеп 6свея Еаясег йап йас оЕ Е. соП КХА ро!угпегаяе, спеаяигед ипс1ег йе яагпе сопд!сюпя. ТЬе К ча!иея оЕйе ТЗ апй Т7 КХА ро!угпегаяея Еог АТР, ()ТР, апд СТР аге Ъепчееп 40 апй!00 рм (ОаЫеу ес 9.88 СЬарсег 9| Ргерага6оп о! лчайсо!аЬе!ей РлчА апй Я)чА РгоЬел а1. 1979).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
