Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 65
Текст из файла (страница 65)
бТР ь апоша!оиа, ргоЬаЫу Ьесаиае |с Ь чьей аа а сЬаш-|ш6аппд пис1еосЫе; $(Ь)А сЬаша ш!1)асе|$ Ъу ТЗ КЫА ро!у|пегасе, сог еха|пр1е, асагс |чпЬ рррбббА ап|$ рррбббб (сог геч(ечч, р!еаае аее СЬап|Ъег1ш ап|$ Куап 1982). Ъ1|Ьеп сЬе сопсепсга6оп оГ сешр1асе РЫА Ь 20 пм апй сЬе сопсепсга6оп оГ еасЬ оГ сЬе г)4ТРа Ь )50 Слм, сЬе гасе оГ КХА аупсЬеж ь !шеаг сог ас !еаас 1 Ьоиг апй ь ргорогс(опа) со сЬе апюипс ог" епхугпе а|Ыей со сЬе геассюп. Риппд сЬе соигае о( сЬе геассюп, В)ч)А сЬаша аге ш|6асег1 гпапу сипел оп еасЬ |по!еси!е ол сешр!асе, апй, ипйег орсипа! сопй6опя Ьесъчееп 10 апг1 20 гпо!еа оГ 6лП-1епдсЬ сгапаспрс аге депегасей рег п|о!е о( сегпр1асе. Ноччечег, лчЬеп а гайо!аЬе!ей ог п|ог66ей Ьаае Ь иаей аа а ргесшаог, сЬе у)е!й Ь ппкЬ!оъчег Ъесаиае геас6оп сопйсюпа аге |пойбей со орсипсхе шсогрогасюп оГ сЬе гаге со|пропепс.
ТЬ)а Ь депегаПу |$опе Ьу е1ипшасшд сЬе Ьогпо1одоиа пис!еосЫе агою сЬе геассюп ог Ьу 1оъчеппд сь сопсепсгасюп с$гаа6саду. Ноччечег, 11 сЬе сопсепсгасюп оГ пис!еосЫе ш ТЬе геассюп г1гора Ье!оъч ТЬе К пос оп1у сЬе соса1 у|е!с1, Ьис а1ао сЬе ргорог6оп оГ Ьлд-1епдсЬ И'~А сЬаша чйП йгор |пас!се|Ну. АЫюидЬ аП сЬгее Ьассег!орЬаде ро!у|пегааеа аЬаге п|апу ЬюсЬе|пка! ргорег6еа, еасЬ йьр1ауа сопяйегаЫе рге(егепсе сог Па олчп ргошосег ап|$ йоеа пос!пП|асе сгапаспр6оп ас осЬег ргопюсега ас а ялЬяап6а! гасе. ТЬе ЬассегюрЬаде епхушеа йо пос гесодпсхе Ьассепа1 ог р!аагпЫ ргоп|осега ог еи)сагуо6с ргопюсега ш с!опей РЬ)А аел)иепсеа.
Весасье ег6с(епс ядпа!а (ог сегпипаг|оп ос К)ч(А сЬаша аге а)ао гаге, ЬассепоРЬаде-епсойей ро!угпегааеа аге аЫе со аупсЬеяге 6лП-!епдсЬ сгапаспрса оу а$гпоас апу Р)ч)А сЬас В р)асей ипйег сЬе сопсго! оГ ап арргорпасе рго|посег. Весаые сЬеае сгапаспрса аге соп|р!егпепсагу со оп1у опе асгапй оГ сЬе сегпр)асе, сЬеу аге ехседепс сог ые аа ргоЬеа |и ч(гсиаПу апу сесЬп(л)ие |пчо!лпд ЬуЬг1й(гаг)оп, шсЬк$шд 5оисЬегп ап|$ погсЬегп ЬуЬпй)галоп, |и ыси ЬуЬгЫ(гас)оп, ап|$ К(ч)аае ргосессюп аяауа.!п а|Ы|- 6оп, |Ье аЬ|1|су со депегасе 1агде |!пап!|Пес оЕ !опд КЬ)Аа сЬас аге Ыеп6са! )п лес)иепсе со ипасаЫе ргипагу сгапасг(рь о( п|апипаПап депеа Ьаа 1ей со гЬе йече1орп|епг ог ш ч|сго |ьаауа лог арПс(пд апй ргосеыпд ог 3' сегпнш ос еи)гагуо6с шКЬ(Аа (е.д., р!еаае аее бгееп 1991).
5упсЬеск ПХАа аге а1ю Пдапйа Еог Ь~пйпд Ьу геди!а!агу ргосе|па аисЬ аа сЬе сас депе ргой|сс оГ гЬе Ьшпап иппишо|$ебс|епсу лпь (Коу ес а1. 1990). РиП-1епдсЬ сгапаспрь ргерагей ш лаго аге ойеп чьей аа шК(ч)Аа ш еи)сагуо6с се1! Ргее ргосеш аупсЬея|йпд ауасепь. ТЬеае ап|$ осЬег геас6опа (е.д., ш лсго ар!кшд геассюпа) лчог)г ей|слеп!!у оп!у 11 сЬе се|пр!асе К)4Аа аге саррей ас сЬе|г 5' сепп|п|.
ТЬе аййсюп ос а 5'-сар асгиссиге а1ао дгеас!у ипргочеа РЬе асаЬ|16у ос К)ч(Аа ш)ессе|$ Ысо оосусеа ((ог ге(егепсеа, р!еаае аее у)агаеП апй Ме1соп 1989). Сарре|$ КЬ)Аа сап Ье аупсЬеяхей ш л с го Ьу 1оччеппд сЬе сопсепсгабоп ос бТР со 50 )лм апй шс1ийпд а сар апа1од (госЬ аа б(5')ррр(5']С) ас а сепГо!й гпо!аг ехсе|ь ш РЬе геас6оп пихсиге (Сои!сегал ес а!. 1982; Копага)са ес а1. 1984). ТЬе дгеас ша)оп!у оЕ сгапаспрь аупсЬеяхей ипйег сЬеае сопй)сюпа аге ши|асей ъч(сЬ а 5'-саррей асгисшге. Нолчечег, опсе К(ч(А аупсЬеяа Ьаа Ьедип, сЬе ресиПаг сЬегпка! асгиссиге ог сЬе сар апа!од (чйсЬ слчо ехроаей 5'-Ьуйгоху! геа)йиеа) епаигеа сЬас по сигсЬег шсогрога6оп ог сЬе сарршд пис!еосЫе сап асс иг.
Ршаду, сЬе ЫВЬ арес)6сЬу ау ЬассегюрЬаде ПЬ)А ро1угпегааеа Ьаа Ьееп ехр1о|сей ш $6е йече!орспепс ог" рго)сагуоск апй еи)гагуоск ехргеяюп ауасеша. Неге, а сагдес сР)4А ог депе ь с!опей йолчпасгеаш 6огп а ЬассегюрЬаде ргоплосег сел)иепсе апй ирасгеап| оГ ап арргорпасе сгапасприоп сегпипасюп аес)иепсе. ТЬе ге|ш16пд гесошЬ~папс р!аяпЫ ь сЬеп шсго|Ьлсе|$ шсо седа ЬагЬоппд а лесопй р!аяпЫ |Ьас ехргеыеа сЬе ЬассепорЬаде К)ч(А ро1успегаае ш а геди!асег1 ГааЫоп.
1пйиссюп оГ сЬе ро)угпегаае депе гели!са ш РЬе сгапасг1рс!оп оЕ ТЬе сагдес РХА оп сЬе Пгас р!аагпЫ апй аиЬаес)иенс аЬипйапс ехргеыюп оЕ |ь епсойей ргойисс(а). !п Е. со1|', сЬе гпоас лчЫе!у иаей шпагу ехргеаяоп ауяе|п ешр!оуа сЬе ЬассегюрЬаде Т7 Е)4А ро1угпегаае апй ргопюсег (ТаЬог апй РйсЬагйоп 1985; дсий!ег апй МоКасс 1986; дсий(ег ес а1. 1990).
)п еи1сагуоск седа, сЬе Т7 ПНА ро1успегаае сап Ье рго|$исей Ьу шуесс!оп чйсЬ а гесо|пЬ(папс чассш|а лгсь сопла!п1пд гЬе Т7 ро!ушегаае депе (Риегас ес а1. 1986) ог Ьу сгапФессюп осап ехргеаяоп р1аяпЫ. ГАСТ6 А)ч(0 Н1)ч)ТД То оЬса(п |пППдгат агпоипса о( К(9А (гоги 1агдееюа(е геас6опя РЬе сопсеп1гасюп о( МПС1, |и сЬе геас6оп аЬои!й Ье ай!иасей со б пм Ыпоче 1Ье соСа! сопсепсгабоп о( пис1еобйеа Ы РЬе геасдоп (М!П)дап ап|$ РЫепЬесд 1989), апй уеая (погдап)с ругорЬоарЬаьзе аЬои)й Ье !пс1ийей ас а сопсепсгабоп о( 5 ип)Ь/гп( (Сиоп)пдЬаш апс( О(епдапй 1990). ТЬе ругорЬоарЬасаае ргечепь аег(иеасгабоп о( Мдлч (п (Ье (оггп о( гпадпеавт ругорЬоарЬасе. Вассеп!орЬаде КС4А ро!уплегсьеа и !П а| сер! Ью6пу1асес1 пис!еобйеа аа ргесигяль.
Ноччечег, согпрагей со га|6о!аЬе)ес1 МТРЬ |псогрога6оп Ь )еаа е6)с!епс апй 1Ье ргойись о( |Ье геассюп сопла)п а Ь)дЬег ргорог6оп о( сгипса1ей КЬСАа (бгаЬои|аЫ апг1 5Ьагр 1986; уьгаед апй Ме!соп 1989). Т7 КсчА ро!ушегаае 'ь а(гопд)у |пЬ!Ь!сей Ьу Т7 )уаохугпе (Модаи апй 51ий)ег 1987; Плейа апг1 Вадеу 1992). Соехрге|ь)оп о( сЬе Т7 1уялхугпе депе Ьаа Ьееп иаей |ь а гпе|Ьой со гейисе сЬе асдч(су о( Т7 ро!ушегаае 'е (сапа(огшей Ьасгег(а ((ог геч)ела, р!еаае аее 51ий)ег ес а!. 1990). Гп)огтаг(оп РапеВ 9.89 1БОЕАТ1(ъ)С О1ЕЕЕКЕВ(Т1АЕЕТ ЕХРКЕййЕО сОВ(А5 ВУ О!ЕЕЕКЕВ)Т1АЕ оСКЕЕМ1В)С АВ)О СЕОВ$1В(С Ввсипасев виддевс сЬас сЬе Ьигпап депогпе гпау епсос1е 70,000 — 80,000 депев (Апсег)пега апс1 В|ей 1993, 1994; р(е!дв ес а!. 1994). Ъъг(|Ь(п а япд!е суре оГ се!1, воте депе| аге ехргеяей ас Ь)дЬ !ече(в апс( осЬегв ас 1оъч!ече!в.
Меавигегпепсв оГ йе )дпе6св оГ геаввос|ас|оп оГ псВ(ъ)А ш |Ье ргевепсе оГ а чаьс ехсея оЕ депопис Р)ъ)А (Ме!1| ес а1. 1971; Навбе апй ВВЬор 1976) вдоъч сЬас -2098 оЕ сЬе гпапппа1(ап гпВНА роро!асюп сопв66 оГ аЬипдапс сгапвспрп (1000 — 12,000 сор(ев)се!1). тВНАв оЕ тейшп аЬип|$апсе (100-1000 сор(ев!се!1) ассоипс Гог а Еиг|Ьег 2598 оГ сЬе гпВ)4А |по1еси!ев, ап|$ сЬе геташ|пд 509о сопвгп оГ а япа!! пшпЬег оГ сор|ев (<13 сор(ев!се!1) оГ а!агде пшпЬег (-30,000) оГ депев ().еъч(п 1975). Рагски1аг суреь оГ гпапипа$|ап се!!в ехргевь вресНс весь оГ депев, сЬе п|а)опсу оЕ ъчЬссЬ Ъе!опд со |Ье тейшп- апй! оъч-аЪипдапсе с1аяев.
Рог ехатр!е, си! Сигед Ьшпап се11в ехргея 20,000 — 30,000 депеь, очес Ьа!Г оГ ъчЬкЬ аге сгаыспЬед шсо !оъч-аЬипдапсе гпд)4Ав (ВВЬор 1974; В(вЬор ес а1. 1974; Вуууе1 апс$ МсСагсЬу $975). Мапппа!(ап Ьгаш седа |пау Ье ехсербопа) ш сЬ|в гедагй |и сЬас йеу со1!ес6че!у арреаг со ехргея а!гповс |Ье епбге вес оГ депев епсос1ес$ Ьу сЬе депогпе (Вапс!е апс$ НаЬп 1976). 1п депега), Ьоъчечег, се1!в оГ йе вате 1шеаде ехргея япи!аг веп оЕ депе|, ъчЬегеав сЬове Егот д|ТЕегепс 1шеадев ехЬгЬ|с дгеасег Йчегясу ш сЬе|г ехргевяоп рапегпв. рог ехагпр1е, йе огдапв оГ Ь|дЬег еи1сагуосеь ЙГЕег Ьу ехргевяоп оГ -2000-4000 депев (Ахе1 ес а).
$976), ъчЬегеав с!ове1у ге!асес$ се1! суре|, висЬ ав В апд Т 1уп|рЬосусев, д(гТег Ьу ехргевяоп оГ оп!у -400 депев (Рачь ес а!. 1982). РНегепба1!у ехргеяед депев шс1иде пос оп!у йове |Ьас аге сгапвспЬед ш рагски1аг сурев оГ се11в ас врес|йс всадев оГ д(ЕГегепс(ас(оп апд йече!орп|епс, Ьис а!во сЬове ъчЬове )ече) оЕ ехргевяоп сЬапдев диппд сЬе се!1 сус!е ог йиппд сшпопдепевВ ог ав а сопвес)иепсе оГ рЬагтасо1од(са) в6гпи!ас|оп. 5ечега! тесЬ- ойв, попе оГ сЬе|п еаву, аге ача|1аЫе со Во!асе висЬ депев, шс!ийпд гапйоп| вагпр1|пд апй вег)иепс(пд оГ сРНА с1опев, й|ТГегепс)а! всгеепшд оГ сРЬ)А 1|Ьгапев, сопвсгисдоп апс$ всгеепшд оЕ виЬсгассес1 сР)ъ)А !|Ьгапев, апй д(ЕЕегепс(а! Йвр1ау (Гог геч)есчв, р!еаве вее доагев ес а!.
1994; дадегвсгогп ес а1. 1997; доагев 1997; Нея е| а1. 1998). Рапдогп Дапвр11щ 5(псе сЬе асЬепс оГ ЫВЬ-сЬгоидЬрис аисоп|асес1 Р)ъ)А вес(иепсйд, В Ьаь Ьесоп|е ровяЫе со веагсЬ Гог ЙГЕегепс)а(!у ехргеввед депев Ьу вес)иепс(пд 1агде пшпЬегв оЕ сРНА с!опев р)с(сед ас гапдогп Ггогп еасЬ оЕ съчо 1|Ъгапев (е.д., р1еаве вее Рпдегю ес а!. 1995). ТЬВ Суре оГ 1агде-вса!е, япд1е-рая вес)иепс(пд В а1во ивед Со депегасе ехргеяед ве|р|епсе сада (Е5Тв), ъчЫсЬ сопса|п епоидЬ |псоппа6оп со |йеп6(у а сгапвспрс (Адать ес а1. 1995; Н|11|ег ес а1. 1996). Весаиве |повс оГ сЬе гпд)ъ)Ав ш сЬе ЫВЬевс-аЬипйапсе с! ая аге йе 1еавс 1$)се!у со Ье д|ТГегепс)а!1у ехргеяей, сЬе сЬапсе оГ ыо1асшд д(йегепс(а!!у ехргеяей депе Ьу вес)иепс(пд сРНАв ас гапдо|п !в 1оъч. То ачо|й ве|р|епсшд аЬипйапс сгапвспрп 6те ап|$6п|е адаш, опе ог тоге гоипдв оЕ йНегеп6а1 всгеепшд сап Ье ыей со гепюче с!опев |Ьаг $|аче Ьееп всгеепей ргечюы!у ог |Ьас соггевропй со ЬгдЫу аЬипс1апс тВНАв (е.д., р1еаве вее Ноод 1991; Огг ес а1.
1994; 1| ес а!. 1997). О|Ьег тесЬодв со шсгеаве сЬе ргоЬаЬ|! Иу оГ НепЯушд сРЬ)А с! опев соггевропйпд со дНегепба11у ехргеяе|$ депев шс! ийе |Ье ые оГ поста!(хед ог виЬсгассей 1|Ьгапев (драпдпн$е ес а1. 1988; Расап)а!$ ес а!. $991; 5оагев ес а1. 1994; Вопа!до ес а!. 1996; Р|а|сЬеп1|о ес а!. 1996), ш ъчЫсЬ йе ппЬа!апсе ш аЬипс$апсе Ьесъчееп сРНАв В соггессес$ со чйсЬ~п опе ог|$ег оЕ гпадппийе, Ноъчечег, сЬе ге|и!|шд шсгеаве ш еГВс(епсу ш всгеетпд соп|еь ас а рпсе: тйсъсАь сЬас дыр!ау 9иапс!сас(че дНегепсев |и ехргеьяоп аге 1овс диппд сЬе вибсгас6че ЬуЪг!д!аа с|оп |сер гес!шгес1 Гог сопвсгис6оп оЕ поппа1гаед ог виЪсгассед 1|Ьгаг(ев.
Сопвес!иепс1у, сРНА с1опев соггевропйпд оп!у со тВ)4Ав сЬас аге д(йегеп6а!1у ехргеяе|$ ш ап а!1-ог-попе Еа|Ыоп сап Ье Во1асей. О(йегеп11а! йсгееп(пд (а(ьо Ке(егге|$1о аь Р!пь!М1ппь йсгееп!пд) 1п |Ье яп|р!евс Гопп оЕ й|в сесЬш|р|е (5с, )оЬп апй Рач!в 1979), а сР)ъ(А 1|Ъгагу В сопвсгиссед (гоп| се11в ехргевяпд йе депе оЕ (псегевс. Рир!касе сор(ев оЕ йе 1|Ьгагу аге всгеепе|$ верагасе!у ъч(сЬ )аЬе!ед сР)ъ)А ргоЬев вупсЬев(гей Егот съчо ргерагасюпв оГ гпВНАя Опе Ггоп| а се1! суре ог 6яие йас ехргеяеь |Ье депе(в) оГ шсегевс ш Ь|дЬ аЬипдапсе апй сЬе осЬег Егогп а се!1 суре ог 6яие ъчиЬ а 1оъчег аЬипйапсе оЕ сЬе сагдес гпВ)ъ)А(в).
ВесогпЬ(паис с!опев |Ьас ЬуЬпйхе ег)иа11у со ЬосЬ ргоЬев соггевропй со депев ес(и(ча1епду ехргеяей (п ЬосЬ се!1 суре|. ТЬеве с!опев аге пос всид(ед Еиг|Ьег. ВесогпЬ(паис с1опев йас ЬуЪпйхе йНегепба!!у со |Ье съчо ргоЬев аге Во!асес$ ап|$ апа!ухед Ьу погсЬегп ЬуЬпйхасюп со с$есегпипе ъчЬесЬег йеу сопсаш сРНАв с$епчес$ Ггогп дНегепс|а1!у ехргеяей гпд)ъ)Ав. 9.90 СЬартег 9: Ртерата6оп о~твайта!аЬе!ей РМА аий ЯМА РгоБев 1п рппслр1е, сЬЬ тпесЬой о! сотпрагаьче ясгеешпд сап Ье ияес1 со ЫепНу апу ЙВ:егеи6а11у геди!асет$ депе. Нолчечег, Ьесаые сЬеу аге сортед тгот сЬе епбге рори1асюп от" тпКХАя, сРХА ргоЬея ыет( ш ЙВ (егепс(а1 ясгеешид аге от" чету ЬлдЬ сотр!ех1су, чйсЬ еасЬ спКХА гергеяепсет$ ш ргорог6оп со гя аЬипдапсе. Еог сЬе тповс рагс, гпапниа1(ап тпКХАя епсойпд ргосешя йас геди1асе сеПи1аг ЬеЬамот аге ехргеяей ас !осч аЬипйапсе апй аге сЬете(оге ргеяепс ас 1олч сопсепсгасюп ш сЬе 1аЬе1ей ргоЬея.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
