Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 139
Текст из файла (страница 139)
5ОЪ5йи[е йт3 пнхг иге апд ТЬе ойег ТЬгее гЫХТР пнхгиге5 Еот йоее оГ ТаЫе 12-10 апс1 саггу ош ТЬе ргогосо1 а5 де3спЬед. ТЬе 5[ер5 [пчо1чед [п Вес[иепсш8 тч[ГЬ Тат[ 0ХА ро!угпега5е аге япн[аг Го ГЬо5е и5ед Гог 5ег[иепа5е (Ртотосо1 5)! 12.48 СИпрсег 12с Г))9А 5ес/иепсйлд МАТЕКйА!.Ь САНТ!ОЬ(: Рйеаве вее Аррепепх 12 Гог арргоргйасе Ьапсй!йпа оГ тасегйа13 тагЬесй мп(Ь <1>. Войег5 апс! ьо!обоп5 Р1еазе зее Аррепспх 1 Гог соптропепсз о( зсосЬ зо1ипопз, Ьи((егз, апсй геаеепсз.
01(исе з(осЬ войипопв со ГЬе арргориасе сопсеп!гапопв. Ое/олсаес! ойзй//ег! Н О Все со/г/) г/с/!и/ТРЕ, в(ос/с во/ис/олв оГ еасИ оГ (Ие Гоиг с/г//ЧТРв (5 тм) г)И/ТРв, з(ос/с ео/и(/олв оГ еасИ оГ сйе Гоиг г/!ЧТРЕ (7 тм) Рогтат/г/е-/оаг/(л8 Ьийег <! ) !Ох ГаЬе/!08 т/хсиге алс/ г/г//ЧТР сИагл ех(елв(ол/сегт(лас(ол т/х(игев СЧЬеп зесйиепсйп8 сегпр!асев йас аге псЬ сп зесопйагу игисшге, гер!асс дбТР сп ЕЬе 10х!аЬе!сп8 гпсхшге агЫ йе ЕЫХТР ехсепвйоп/сегшйпасйоп пихсигев ълсЬ ап ецийшо!аг ашоипс оГ 7-с(саха-2сс(СТР Епкугпе5 апс! Войег5 5х Кеасйол Ьийег 200 шм Тпз-Сй (рН 8.8) 25 шм МЕС1, Таей (5 ить/р/) ог а сйтс/аг (Иегтоз(аЫе О/и/А ро1утегазе Таей сй/ийол Ьиу/ег 25 шм Тпв (рН 8.8) 0.0! гпч ЕРТА (РН 8.0) 0.1596 Тагееп-20 0.159а ЫопЫег Р-40 ТЬепповсаЫе епгушев ршсйей Ггош осЬег ог8ашяпв пгау гес)и(ге з|с8Ьс!у сййегепс геасйоп апсй сййийоп Ьийегз.
Еог орсппа1 Ьийегз оГ шсйнЫиай епхугпев, р!еаве вее сЬе врессйсайопв ргоуЫесй Ьу сЬе псапиуассигег. 1 ипп о( сЬегпювсаЫе РЬ)А ро!ушегаве асймсу Ь ивиа1!у сйеуспесй аз сЬас ашоипс ннЬссЬ ъи!! шсогрогасе 10 пгпо1ев оГ пис!еосЫе ипо ап асЫ-ргессрйаЫе Гогпт сп 30 пипшев ас 70 — 80'С. !ьйос!ейс Асйе!5 апс! О!(коппс!ео64!е5 О//8олисlео(/е/е рлглег Рве аг а сопсепСгайоп о( 1.0 ргпо1е/р! (-6.6 п8!р1) йп ТЕ (РН 7.6). Рог а 1ас о( ишнегва! Рпгпегв йас Ьспй со нессог весйиепсев ирзсгеагп оГ йе саг8ес герои, р1еазе все йе шГогпсайоп рапе! оп 0(зй(ЧЕК5АЕ РК1МЕК5 сп СЬареег 8 апсй йе сп(оппайоп раис! оп СЬе РКЕРАКАТЮН ОЕ 5ТОСК 5ОШТЮ(н(5 ОЕ ОЕ(СОХРСЕЕОТ10Е РК(МЕК5 ЕОК РЬ(А 5ЕО()Е(з(С!Ь(С ас сЬе епсй о( сЬсв сЬарсег.
ТАВЕЕ 12-10 10х ЕаЬеййпе Мйхсиге апсй оой(ТР СЬайп Ехсепзйоп/Тегпс!па(йоп Мсхсигез Гог Рве йп Сопчеп!(опа! 0(н(А-зесйиепс!пе Кеас!1опз Сасайухеей Ьу Тас/ Ро!ушегазе ЕаЬе1ш8 сЫСТР сЫТТР сйс(АТР сЫСТР 15 — 15 15 15 15 90 15 15 15 15 7.5 15 15 15 15 1.5 15 1О 10 10 10 1О !О 1О 10 10 10 975 830 680 800 911 240 15 15 15 120 ТЬе ! Ох (аЪе1ш8 пихшге саасашв ИСТР, н(СТР, ааа 8ТТР, еасЬ ас а сапсеисгаиап а( 7.3 рм. ТЬе гаиав а( нЫХТР дар ш йе (ааг сйн(ЕСТР ехсепяап)шпишаиаа пихшгез аге 30 С, ЗО С, 80 1, ааа 3! Гог С, Т 6, аай С, швресс(не(у.
ТЬе сох (аЬеЬа8 пахшге апа 88ХТР ехсепиаа/сепшааиап аихшгев вЬаиЫ Ье 8)вреивеа ш 30-р( аиаиаь аад иагеа (гогеп ас — 20"С. 5тоск 5оситюп ое др)ТР хпо аар(ТРз (Ап Чосимев ш 1 Отнеа Кехсеятв Кехстюп асТР дТТР аАТР ИСТР сЫСТР гЫТТР ЕЫАТР ддСТР Тшв-Сс Е РТА Мсхтиае 1 шм 1 шм 1 шм 1 шм 5 ам 5 шм 5 шч 5 пм (1 ч,рН8.0) (10шм,рН8.0) Н,О Ргогосо! 5: Р(г(еоху-тег((а(ег( Бег(иенс(п5 ОТ РЮА (Тя!п5 Тая! РХА Ро(утегаяе 12А9 Тетр(а(е ОХАЯ Г700 пд(р!) гл ТЕ (рЕ( 2.6) 5)п51е-я!ганг(ег( (37(А (500 п5) ог 1.0 Нц оИепагнгег( г(онЫе-я!ганг(ег( р!аягпЫ Е)ЫА В гег)н(гег( Еог еаеЬ ьег о( Еош ьеОнепешц геаеиопь. ()епагнге апг( аппеа1 йе 1шеаг г(онЫе-ыгапг(ег( 0Ь(А го рг(пяег Ьу ш(х(п5 йе паиче гешр1асе НЫА п(гЬ ап ехеея оЕ ргнпег, Ьеаг(п5 гЬе пихгше ш а Ьогап5 ячагег ЬагЬ Еог -2 пнпнгея, апг( йеп р1нп5!п5 йе гнЬе шго ап (ее-ячагег ЬагЬ.
!)о пог ааояч гЬе пах!иге го ячагш нр; ые (пяшегпаге(у. ТЬе сопсепггабоп оГ ьПп51е-я(ганг(ег( (7Ь(А (п япаП-ьеа!е ргерагагюпя оЕ Ьае(ег(орЬаце М13 гесошЬ(- папи чапеь (гоги 005 го 0.5 Нц)гп!, г(арена(пц оп (Ье цгоннЬ гаге оГ (Ье рагбен!аг Ьашег(орЬаце. ()пг(ег гЬе сопеаиопя поппаау ньед Еог яег(непешц геаебопь сага(угег( Ьу Таг( ро!угпегаье, гЬе гегпр!аге Г)Е(А Ь ргеяепг ш ехеея.
ТЬегеГоге, янаП чапаиопь Ы гЬе ангонпп оЕ гетр!аге аг(Пег( го ййегепг ьеп оГ яег(нане(п5 геаебопя «(о пог Пепегаау аЕЕесс гЬе Она!ау оЕ гЬе гехи!!я Ьопечег, р1еаье яее гЬе рапе1 оп ТЙО()ВЕЕ5НООТ!ЫС ш Ргогоео! 4. Кайоас113<е СотпроопеЬ (аГ~пР!сlАТР (3000 С((гпто(е, 70 гпС((т0 <! > ог (а-ья5!г(АТР <7000 С((тто(е, 70 тСНтИ <!> ог (а-ььР!г(АТР Г2000-4000 С()гпто!е, — 70 гпСг(тИ <! > ог 5' ьгр-!аЬе(ег( о!(полис!еойг!е рптег <! > 1пьгеад оппгегпа1 (аЬеанц яч(гЬ гагпо1аЬе!ег( г(АТР, сапу ош ьег(пепе(пц ьч((Ь ап оППопне1еогЫе рпшег (аЬе!ег( аг гЬе 5' епг( ннгЬ "Р ог 'яр. 1п йгь саяе, !.0 — !.5 ргпо1еь о( йе гайо1абе1ег( рпгпег апг( 2 Н! о( Н О аге (пс(нг(ег( !п йе геаегюп пнхгнге гп р!асе оГ йе нп(аЬе1ег( рпшег (5гер 1) апг( гагпо1абе1ея( г(АТР (гаер 6).
АП огЬег перь геша(п гЬе ьагпе. ТЬе 5' гегшш( оГ оППопне!еогЫеь аге Пепегаау !аЬе1ег( Ьу ггапь<ег оЕ !7-ир! Егогп [у-"Р!АТР (п а геаегюн сага(угеП Ьу ро!упне1еогЫе Ыпаяе. Еог г(егааь, р!еаье яее СЬаргег 1О, Ргососо1 2. МЕТНО0 оГ а писго!1!ег р(а!е, асЫ: 5.0 р( 1. То а 05-гп! писго<иае !иЬе ог ьчеП яп51еппапйеО гегнр1аге РЫА (250 Йпо1еь) (100 п5(ПИ оППопнс1еог(Ое рпгпег (0.5 рпю!е) (-3.3 пд)01) 5х геаегюп Ьн((ег 3.0 н! 2.0 (г1 2. (псиЬа!е !Ье !(ПЬ!!у с!оьес( !иЬе Еог 2 пипи!еь а! 65"С.р,еточе !Ье (иЪе Ггогп йе ячасег Ъай апг1 а!1Ояч П Со соо1 (о гоот Сетрега(иге очег йе соигяе оГ 3 — 5 пипи!ея. 5оше (пчеящагогь рге(ег го соо1 гЬе аппеаап5 геаеиопь пюге я(отч1у очег (Ье сонгье о( 30 пипшеь ш а япаП Ьеаипц Ыое(г ог ЬеаЕег о( ячагег.
1п оог Ьапг(я, Ьой ь)ояч- апг( Гахн-еооПп5 ге5(гпепя угеЫ яег(непее оГ гЬе яапье г)наПгу. 3. ТА7Ы!е йе рпгпег апг( !етр1а!е аге соо!(пе, !Ьачч (Ье 10х 1аЬе!(пе апг1 гЫЫТР ех!епь(оп)(ест(па!(оп пих(нгеь апг! гаг(10!аЪе!ес( г(АТР. 5!Оге (Ье !Ьаъчег( яо(п((опя оп гсе. прес!а! Ецо!р(пеп1 М(его<нее ЕиЬеь <0.5 т0 ог Мкго!(гег р!а(еь ГГ!ек(Ые, Ьеа(-ь(аЫе, ччгй 96 Е)-ьбарес( гче!!ь о< -300 р! сарае((у) Р1еаье ьее гЬе!п(опнагюп рапе1 оп М!СКОТ!ТЕК Р1АТЕ5. РгоцгаттаЫе (Ьеггпа! сус!ег 67(ес! ьчг(Ь ти!(гчче!! Йеа( Ыос(еь Ге.ц., Ог(-В!ос(г сус(егь, ТесЬле) 1.еы ьаг!4(аегогу апегнабчеь аге ячагег ЬагЬь ргеЬеагег( го 45"С апг( 72'С; р!еаье ьее ноге го 5гер 8. Яа(ег Ьай ргеЬеа(ег( (о 65'С Рго1осо! 6 Сус!е наес!иепс~пц: ОМеоху-тейа1ес! наес!иепс~пц Кеас6опь Выпь РСК.
апс! Епс1-!аЬе!ес! Рптегь с гссе Г)И)А ьщглгншнс !мохг Р8Орех!т САЫО тНЕХМАГ Сгеге РХА лег)иепс!п8 ог 1шеаг аплр1гбса6оп ЕлЬ!А яег)иепс!п8) )х а гесЬпи!ие !п иЬкЬ ахупипеибс РСК )а ихег) го 8епегаге а яп81е-хггапг)ед сеплр1аге Гог зег)иепс!п8 Ьу йе Зап8ег с1Ыеоху-сЬаш гегш)паг!оп гпейос1 !СагогЬега ег а1. 1989; Миггау 1989; Сгахгоп 1991; 1ее 1991; Е. 1.ее ег а!. 1992).
Роиг аерагаге ашр66са6оп геасгюпь аге ьег ир, еасЬ сопла)п)п8 гЬе аале о!18опис!еогЫе рпшег апс) а гЬГГегепс сЬа)п-гегш!паг!п8 г!г)ХТР. Тип сусбп8 рго8гапы аге гурка11у иеег) !п а сус1е-лег)иеллсш8 ргогосо!. !п йе Глас рго8гагп, геас6оп пнхгигея аге ьиЪ)есгег) го 15 — 40 гоипг)ь оГ сопхепг)опа! гЬеггпа1 сус1ш8 !е.8., р1еаае хее На11огап ел а!. 1992; Ри1лоп апг) ЪИ1аоп 1994). ЕасЬ ашр1гбса6оп сус1е сопяяа оГ йе авиа! гЬгее яеря г)епагигаг!оп оГ йе г)оиЫе-ягапс)ег) ГлЬ!А гегпр!аге, аппеабп8 оГ а ллр-1аЪе1ед хеииепс!п8 рпгпег го )га гаг8ег хе~)иепсе, апд гЬеп ехсепяоп оГ гЬе аппеа1ед рпплег Ъу а гЬегпюяаЫе ПЬ)А ро1ушегахе апг) гегпл!паг!оп оГ йе ехгепг)ег) хггапг) Ъу шсогрогагюп оГ а лЫЯТР.
ТЬе геял16п8 раг6а11у доиЫе-аггапс)ес) ЬуЪгЫ, и ЬкЬ сопят х оГ ГЬе 6л!1-!еп8лЬ лешр1аге ягапс1 апг) )ь согпр1егпепгагу сЬа)пнегпипагег) ргос1исг, )х г)епалигег) йп.- !п8 гЬе Глгьг хгер оГ гЬе пехг сус1е, йегеЬу 6Ъега6п8 йе сешр!аге аггапг) Гог апойег гоипг) оГ РПпип8, ехгепяоп, апг) легпшзагюп. ТЬегеГоге, йе га66о1аЬе!ей сЬалп-легпипагес1 ргос)исгв ассиши1аге )п а Епеаг ГаяЬюп г)иг!п8 йе еп6ге 6гьл РЬахе оГ йе сус!е-ьег)иепс)п8 геасгюп. !п гЬе аесопл) рго8гап1, лЬе аппеабп8 яер гх опт!лег) ло гЬаг по Гшйег ехсепяоп оГ рг!шегх !х роя яЫе. !пяеаг), гЬе "сЬаье' ье8шепг ргохЫел ап орроглипбу Гог 6лгйег ехгепхюп оГ геас6оп ргог)ись гЬаг и еге пог легш!пасед Ъу шсогрогаг1оп оГ а г)г)ХТР г)иг)п8 йе ш)г1а! гоипг)х оГ сопхеп6опа1 йеппа1 сус!1п8.
ТЬе гарбо1аЪе!ес1 ргос)ись оГ сус1е-хег)иепс!п8 геасг!опа аге 6па11у с)!я р!ауег) оп а с)епагиг)п8 ро!уасгу!ашЫе 8е! апс) г)есесгел) Ьу аигогаг))о8гарЬу. ТЬе Го!1ои!п8 аге хоппе оГ гЬе аг)чапга8еа оГ сус!е аег)иепс!п8: ° Ыог)га аа и еП ичг)л гГоиЫе-хггапг1ег1 ах и 11)г атее-хггапг)ег1 гетр!асей !СагогЬегя ес а!.
1989; Миггау !989), йегеЬу е!ипша6п8 йе пеег) го гшЬс!опе йе РХА оГ !пгегеяг !пго ЬасгеПоРЬа8е М ! 3 ог РЬа8ешЫ неслося ° Ргег)и!ген оп1у Гетгото1е атоипгл оГ гетр!аге. Бирбслепг Р!!А сап Ъе оЬга)пег) 6огп а яп81е р1а<рюе ог со1опу ог !гогп а РСК ргог)исл рип6ег1 Ггогп а 8е1 Г8пигЬ ес а). 1990; КПьЬпап ег а1. 1991; Кгегг ег а1. 1994). 12.51 !2.52 СЬаргет 12: Р)чА 5ег!иеисгиК ° Сап Ье ее! ир ги еггЬет тгсто6гет р!а!ей от т!стоуиКе !иЬея ° Саи Ье айареейуот иее гч!ГЬ ттетпа! !аЬе!тц Ьу иаир-, анпр-, ог а-а~5-!аЬе1ед пис)еоти1еь (СагогЬегз ег а1. 1989; Миггау 1989) ог чч!1Ь 5'-1аЬе1ес1 ргппега (1.ее 1991; Киапо апд КнЫ 1991; 5еагк ег а1.
1992). Сус!е аес)иепс!п8 сап а!ко ассопнподаге Ью6пу1агес1 апд 6иогексепг!у 1аЪе1ес1 пис!еог!дев (е.8., р1еаке аее чгг!!хоп ег а1. 1990; Стоне!1о ег а1. 1992; Ри ег а!. 1993; Чоаа ег а!. 1997). ТЬе 6иогеасепг !аЬе!х сап Ье аггасЬед го еКЬег йе 5' епс1 о! йе рппгег ог го ГЬе сЬаш-Сегпнпадп8 пис1еоГ!деа (КоьепГЬа! апд СЬагпос)с-!опек 1992).
° Сап Ье изей и гй соттетс!аПу аьа!1аЫе тоЬог!с ччот!гагат!от (Спдге!1о ег а1. 1992) апс1 аигогпадс РХА вес)иепсегх (Стах!оп 1991; Коьепйа! апд СЬагпос)с-!опт 1992; 5еагь ег а1. 1992). ° Ассерта лис1еогЫе аиа!ор ьисЬ аа 7-йеаеа-йбТР (М!тиаачча ег а1. 1986) апд д1ТР, гчЬ!сЬ гедисе Ьапд согпргеаяопа дипп8 е1ессгорЬогеяз (5еага ег а!. 1992) (р1еахе а1ао хее йе гп!огша6оп рапе1а оп СОМРКЕ55!О6151М О!чА 5ЕЯБЕ61С!ХС СЕЕ5 апд оп 7-РЕАЛА-ИСТР).
° Саи Ье тойфей го оЬгат гЬе ьег!иеисе о7' еасЬ егтаий о! а йоиЫе-хгтаийей РА(А гетр1аге (Киапо апд КнЫ 1991). ° Сап Ье айаргей !Ьт тарЫ астеетпд от ро!иг тигапь (Сагойегк ег а1. 1989; Нассог! ес а1. 1992). ТЬе 1сеу го сопяаГепс хиссеха ш сус1е аег!иепс!п8 !а йе с!еап1!пеах оГ йе гегпр1аге РЫА. 1шриг!г!ех яюЬ ах а8агоае, аа11я апс1 ргоге!пх а1! саихе ргегпагше гегпнпагюп апд раиа|п8 ог" Р)чА ро1угпегаьея гчЬегеаь о68опис!еог!деа ргодисед Ьу де8гада6оп о! РМА апд К)х)А саиае !а!ье рппнп8. ТЬеке иприт!г!ек 1еад го ап ипассергаЫу ЫВЬ !ече! ог !а1ке ЪапсЬ апс1 "ешрсу" Ъапдх (а!хо )споъчп ак дгороигх). Весаые гЬе оп1у я8пгбсапс аоигсе ог !шрипг!еа !п йе ьег)иепс(п8 геасг!опь !а гЬе гегпр1аге РХА, ргоЫеша сап ыиа1!у Ье ргечепгед Ьу риг!гу!п8 гегпр1аге Р)ч)Аа Ъу сЬгогпаго8гарЬу ГЬгоиВЬ арии со!шпио о! 5ерЬагоье С1.-6В ог 5ерЬасгу! 5-400. чггЬеп ргерапп8 сешр!агеь угогп яп81е ЬасгепорЬа8е М13 ог Х р1ас)иеь, иае аВаг ог а8агоае йаг !х гчаггапгед го Ье !гее о! !пЫЫгогх о! РЫА ро1ушегаьея язеп РСК !х иаед го Вепегаге гЬе РХА гешр1аге, геяс)иа1 рг!гпегх ьЬои1д Ье гепючед Ьу хрип со1шпп сЬгогпаго8гарЬу, Ъу е1есггорЬогех!х 1Ьгои8Ь а8агоае ог пеигга! Ро1уасгу1агпЫе Ве!я ог Ъу сепгпуи8а! и!гга6!ггагюп гЬгоиВЬ с1ечдсеа ьисЬ ах Сепгпсоп-100 ог М!сгосоп-100 ип!гх (Кгоччсхупк)са апс1 Непдегкоп 1992; 1.еопагс1 ег а! 1998; р1еаье аее СЬаргег 8, Ргогосо! 3).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
