Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 99
Текст из файла (страница 99)
А!(егпайче)у, а СНЕЕ Ьехай >па) апау ьуагегп сап Ье иаед ъч!й аъч)гсЬ Втеки гагпр1п8 1гогп 1 (о 150 аесопда(ри)ае аг 9 Ч)ст (ог 20 Ьоигь аг 15'С, (Хиптег апд Чегппс)ег С!ЬЬ!пь 1997). Еог адсйиопа1 )п(оппайоп оп РЕСЕ, р1еаае ъее СЬарсег 5. МЕТНО0 Ейпеаг!тат!оп апс! 0ерЬойрЬогу!ат!оп оЕ ЬорегСой-Т 0Ь)А 1. СогпЪгпе 20 рй оЕ 5ирегСоя1 РЫА ъчЬЬ 50 иппа оЕ ХЬа! гп а чо1шпе оЕ 200 р1 оу 1х ХЬа! д(8еьс(оп Ьийег апд шсиЬасе йе геасдоп ппхгиге (ог 2-3 Ьоиш ас 37"С. 2.
АЕ(ег 2 Ьо ига оЕ (псиЪапоп, сгапауег ап а1н)иог (-1 р1) оу(Ье геасдоп ппхсиге 1о а ЕгеаЬ сиЪе. Апа1уке 1Ье а1(с)ио1 оу сояпЫ Р)ъ)А Ьу е1ес(горЬогеяа 1ЬгоиВЬ ап 0.8% айагоае 8е1, ияп8 аа сои!го!а (1) 50-100 пй оЕ аирегЬе1(са! ВирегСоя1 Р)ъ)А апд (й) 50-100 п8 оЕ а ЬассепорЬайе Х Р)ъ)А д)йеагес1 ъч)й Нтд)11. !Е йе сййее6оп ъчиЬ йе геяггс6оп епауте Ь сопър1есе, ай ог сЬе знрегЬейса! 5нрегСоя1 Тъ!4А ъч!!1 Ьаче Ьееп сопчеггед го а )теаг 7.9-1сЪ Тгайтепг ог (37(А.
11 ьнрегЬейса! ог шс)сед Тесть о(5ирегсоз-1 Тъ)4А аге я!11 ч(яые, адд 10 тоге ншь о(ХЬа! со йе дййеег апд соп6пне гпснЬаиоп ас 37 С нп617Ье геас6оп Ьае йопе со согнр!есюп. !1сЬе ХЬа1 ййеедоп Ь пос согпр!есе, йе 11Ьгагу чг!1! солса(п а яйпгйсапс пнгпЬег огсо1ошез йепегасед Ьу сопсагетег(гагюп о(сЬе чесгог.
3. Ехсгасг 1Ье д)йенс)оп геасдоп опсе ъч(1Ь рЬепойсЫогоуопп апд опсе ъчЬЬ сЫого(опп. 4. ТгапаГег 1Ье ас)неона рЬаье со а ЕгеаЬ гиЬе апд гесочег йе 1шеапгед сояпЫ Р)ъ)А Ьу асап- дагд ргесърггадоп ьдй ейапо1 апд аиЪкес)иеп1 ъчааЬъп8 ш 70% е1Ьапо1. 5(оге йе ореп гиЬе Ргогосо! )т Соиттгисдоп оЕ шепот(с РХА Е.тЬгаг!ел т СолтИ Уесгогл 4.19 зп ап (пчегтед роядоп оп а Ъес1 оЕ рарег тоъче!г то а11оъч тЬе ейапо! то с1гаш апс1 ечарогате. Р(аао1че тЬе с1апзр ре11ет оЕ РЫА (п 180 и! оЕ Н О.
Кегпоче а 100-п8 а1н!иоз оЕ (Ье Р)ъ)А Еог цае аа а соптго1 (р1еаае гее йе рапе! оп 0ЕРНО5РНО)(уЕАТ)О)ъ( )(ЕАСТ1ОЫ5). !и юлие сояпЫ честогл (е.8., 2СКВ), тЬе за о сот мел аге лерагазед Ьу с!еача5е ъч(тЬ а геътпстгои еигугие тЬаз сгеатег Ыиит еисЬ. 1и тЬ(г сале, дерЬоърЬогу)ат(ои оЕ йе 1(иеаг(гед честог (5тер 5) Ь ио 1ои8ег иесеыагу, ТЬ(ъ )л Ьесаиъе соисазетиепгатгои оЕ тЬе чеезог саи Ье гирргееаед чету еЕЕес6че1у Ьу зис1иеаи8 Ь(8Ь соисеиггатгоиь оЕ АТР (5 зим) Ы йе 1з8атгои ЬиЕЕег (Реггез6 аид 58агатие!1а 198 1 ). РерЬолрЬогу!изгои оЕ тЬе 8еиоиис 0)4А гиилт л611 Ье сагпед оит со ргечеис сгеатюи оЕ сЬ(изет(с с1оиея 5. Адд 20 и! оЕ 10х дерЬоарЬогу1ат!оп ЬцЕЕег то йе гетпа(пдег оЕ (Ье Р)ъ)А ао1ит!оп.
Адд О.! ипзт оЕ С1Р апс1 !псиЬате тЬе геасдоп Еог 30 ш(питеъ ат 37'С. АлЫ а гесиод а1(т)иот (0.1 ипЬ) оЕ С!Р апс1 сопт(пие д)8еатюп Еог ап атЫттюпа! 30 тпшитея ТгаплЕег (Ье геасдоп (о а ъчатег Ьа(Ь лет ат 65'С апс1 (псцЬате Еог 30 ш(пцзеа то !пасбчате С1Р. йетпоче тъчо 100-п8 а1н!цоь оЕ йе РЫА Еог цае аа сои!го!а (р!еаае аее йе рапе1 оп 0ЕРНО5РНОКИАТЮН КЕАСТЮ(ь(5).
6. Ехтгаст йе геасдоп п~хтиге опсе ъч((Ь РЬепоЬсЫогоЕопп апд опсе ъч(1Ь сЫогоЕопп. Кесочег йе!шеапгед, дерЬогрЬогу1атед 5ирегСоя1 РЫА Ьу гтапдагд ргесзрдадоп ъч(й ейапо1 апс1 ялЬгес)цепт зчааЬ(п8 гп 7058 ейапо!. Рьго1че йе с1ашр ре11е( оЕ Р)ъ(А ш 180 и! оЕ Н О. УЕАТ!ОМ Е!ЕАСТ1О(ь(5 П(оп о( а Вепоиз(с 1зЬгагу )и доиЫе соа чеПогг гет(Ыгеь (Ьат йе Ьпеагыес1 честит Ье рЬогу1азед. 0и(опииате1у, (Ьеге (ъ по ягир(е ъчау то гиопаог йе рго8геъь о( (Ье ! ас6оп сага)угад Ьу а))са)(пе рЬоарЬатаъея Ноъчечег, япсе 0)ъ(А пзо1еол!ег (ас(ъ(п8 ате геа(диег саппос Ье 118атег) то8ейег, йе яксеаг ог (Ы)иге о( (Ье дерЬогрЬогу(ааъъеаъед Ьу сеът(п8 ъчЬе(Ьег йе 1(иеайгед 0(ъ(А саи легче аъ а ъиЬътгате (п !з8атюп Ьу ЬастепорЬа8е Т4 0)ъ(А 1!Ваге.
ТЬе он(сопле о( сЛе !18а6оп геас6оп сап Ье а8агоае Ве( е(естгорЬогег(г (р1еаъе гее Ье1оъч) ог Ьу соизрапп8 (Ье еЕ8с(еису ъч(тЬ гу1атед апд рЬоърЬоту)атед сояпЫ 0МАь сап, а(тег !18атюп, тгапг(огиз Е. со((. ъЬои(д гедисе (Ье е(йс(епсу о( (тапа(огизатюи Ьу ат 1еаът 1004оИ. п о( 5(ер 4, тгапъ(ег а 100 и8 а(к(иот о(ХЬа(-д(8еътед 0МА то а (геъЬ гп(сгози8е ЫЬе 2. Ат йе соизр)етзоп о(5(ер 5, тгапг(ег Ьчо 100-п8 а)к(иоЬ о(ХЬа)-д(8еатеФС)Р тгеа(ед чеПог 0(ъ(А то аерагате гизсгоуи8е ЗиЬеь (ТиЬег 2 апд 3). ' 3. ТоаПйгеетиЬег, адд18и( о(Н О (ойоъчед Ьу2 и( о(10х 118аъе Ьи(уег.
4. То ТиЬеь 1 апд 2, адд 0.2 Чче)ъг ипзь оЕ ЬасйегюрЬа8е Т4 0(ъ(А 118аъе. (псиЬате а)! йгее тиЬеа (ог 3 Ьоигь ат гсюиз тегирегатиге. 5. Апа1уге (Ье 0(ъ(Аъ Ьу е1естгорЬогеяа (Ьгои8Ь аи 0.8% а8агоъе 8е(. ТЬе 0МА д!Вегтед чдй ХЬа) а)опе (ТиЬе 1) гЬои16 118асе зо (ье)1, Еоптип8 д(изегя с1оъед Ыгси!аг пзогюпзегя апс) Ь)8Ьег.огдег изи!()гиегя А(тег гегиоча1 о( 5'-теппзпа) рЬогрЬасе геядиег, йе 0(ъ(А гЬои(д ио!оп8ег Ье сараЫе о(88атюп (ТиЬе 2) апс) г)зоиЫ йеге(оге д(гр)ау ап е)естгорЬогет(с рацегп ягп8аг Со ЗЬат о( ЗЬе 0(.ЛА о( ТиЬе 3 (ио 1(8аге соитго0.
6 аиу 1з8атюи ргскйлсЬ аге ъдяЫе зи ЗЬе 01(А о( ТиЬе 2, 1Ье дерЬоарЬогу!атюп геассюп (5(ер 5) азиат Ье гереазед. 50186оп оЕ Йе Со5птЫ Агпт5 7. ТгапаЕег ап а!!г!иот оЕ тЬе дерЬогрЬогу1атед Р)ъ)А (50-100 п8) то а ЕгеаЬ шкгоЕц8е шЬе апс1 азоте 11 оп ке. АсЫ 20 и! оЕ 10х ВатН! гегтпст!оп ЬиЕЕег то тЬе гепзашдег оЕ йе деарЬоаРЬогу1а!ег1 Р)ъ)А. АсЫ 40 ип(та оЕ ВатН! апс1 шсиЪа!е йе геаст!оп Еог 2 — 3 Ьоигг ат 37'С. В.
АЕ(ег 2 Ьоига оЕ шсиЬатюп, гегпоче а аесопд а1!г)цот оЕ Р)ъ)А со а герагате ппсгой8е шЬе. Апа!уге Ьой а! нрлоь оЕ Р)ъ)А Ъу а8агоге 8е1 е1естгорЬогеяя АЕтег д(8еа!!оп зч((Ь ВатН1, йе 4.20 СЬартег 4: (40г)г!п8 илй Ням-сарастту Нес!оп !тиеаг 7.9-)сЪ Ега8теис оЕ г!ерЬоярЬогу1асес) ВирегСоя-! Р)ч)А яЬои1г) Ье с)паис!сас)че1у с1еачес) (пто Пчо Р)ч)А Егацтпеитя оЕ -!.1 апг! -6.8 (сЬ. !Е сгасея оЕ сЬе 7.9-)гЬ Р)4А аге яп!1 66Ые, а66 ! 0 итоге ипия оЕ В ппН! со йе г88еяс авт( соп6пие (псиЬасюп ас 57'С ип6! сЬе геассюп Ьая 8опе со согпр!ебоп. Ехсгасс сЬе с(!8еяс!оп геас6оп опсе тчтсЬ рЬеиоЬсЫогоЕопи апт1 опсе тч!(Ь сЫогоЕопи.
Кесочег сЬе Р)х)А Ьу ясапг1аЫ ргес(рПа6оп ътбй ейапо1 ЕоПотчет1 Ьу чтаяЬ)п8 тч!й 70% е(Ьаио1. Ртяяо)че йе г!атр реПес оЕ Р)х)А ш 20 тт! оЕ Н,О апт( ясоге сЬе 001исюи ас 4"С ип! П пее6ед. Раг6а! 0фе56оп оЕ Н!ф-гпо!есст!аг-татефЫ Сепогптс 0МА ЕясаЫтяЬ сЬе сопт66опя Еог раг6а! сП8ея6ои оЕ а 30-ст8 яатпр1е оЕ Ь!8Ь-то1еси1аг-иге!8Ьс Еепот!с Р)ч)А сч!ЕЬ МЬо1. ТЬе апп ь со еясаЫьЬ соисП6оия йас ргог1исе сЬе ЫКЬеяс у!е!6 оЕ Р)ч)А Ега8тепся тч!(Ь а тода! яхе оЕ 38-52 1сЪ.
Рог Еиеаапсе )в еясаЫЬЬтп8 сопйбопя Еог рагс)а1 г88ея6оп оЕ Еепош(с РНА, р!еаяе яее СЬарсег 2, Ргососо1 т7. ТЬе рго8геь оЕ йе й8еябоп сап Ье Ео!!отче6 Ьу РРСЕ ог, !еы 6еягаЫу, Ьу е1ессгорЬогеая сЬгоиЕЬ а 03% а8агояе 8е! ияп8 ая тпаг)гегя (!) ипа-1еп8й ЬассегюрЬа8е т РЫАя авт))ог (Е) пш!шпегя о( ЬассегюрЬа8е т Р)9А !)Еасе6 ас йе соя ясе авт) йеп раг6а1!у йаеясед тч)сЬ а геяст)ссюв епхуше йас с!еачея йе 1шеаг х РЬтА опсе.
ТЬе 0.5% а8агояе 8е!я аге чету я!орру авй аге Ьеяс роигег! апг! гип ас 4"С ас!аяччо!са8е (1 — 2 Ч)сш) Еог !оп8 реиотЬ о(сапе (т5 — 24 Ьоигя). СятЬеп оп1у япа!1 апюипь оЕ йе 8евопвс Р)4А аге ачат1аЫе (е.8., тчЬев сопясию6п8 !(Ьгапея оЕ Вотч-яогсе6 сЬгоптояошея ог 8е)-риг)Ее6 уАС Р)4Ая), сопс06опя Сот раг6а1 й8еясюп сап Ье еясаЫ(яЬег( ш япа!1-яса1е геасповя сопсашш8 50 — ! 00 п8 оЕ Еепопвс Р)4А авд 6!ЕЕегевс апюипь (0.0005-0.00! ишс) о( геясис6оп епхутпе.
АЕсег г88еясюп Еог 15 пиписея, а!)циося (то — 20 в8) оЕ еасЬ геас6оп аге ава!ухет( Ьу РРОЕ апс) 5оисЬегп Ыос6в8 ъчЬЬ а гере6сгче РЫА ргоЬе. Рог Евгйег Йеса(!я, р1еаяе яее Ьоп8ш)ге ес а1. (! 993). 10. Е)я!п8 йе сопеПсюпя Еог рагба1 г68ея6оп еятаЫ!яЬет) !и 5сер 10, яет ир тЬгее 1аг8е-яса)е геас6оия еасЬ сои(а!и!иц 100 тс8 оЕ Ь!8Ь-то!еси1аг-тче!8Ьс Кепогптс РХА апд апюипь оЕ МЬо! сЬас Ътас1сес сЬе ор6ита1 соисеисга6ои, ая г)есегпипег1 ш 5сер 10. Ас тЬе еис1 оЕ йе шсиЬа6оп регюй сЬес)с йе я!2е оЕ ап аПс)иос оЕ еасЬ раг6аПу сП8еясе6 РХА Ьу а8агояе Ке! е1ессгорЬогеяя, ая т(еяспЬег) !и йе посе со 5сер 10.
12. 0ер!то5рЬогу!а6оп оЕ Н!ф-гпо!есо!аг-татеф!11 Сепоппс 0)х)А То йе геяияреидес1 раг6аПу с68еясег1 8еиопис Р)х)А, агЫ 20 )т1 оЕ 10х г1ерЬоярЬогу!а6ои ЬиЕЕег аиг1 2 ипЬя оЕ С1Р. 1пппесПасе!у тч!(Ьг)гатч а яатир1е оЕ Р)ч)А Еог ияе ая а сопсгоЬ а. Реточе аи а!нрюс оЕ йе геас6ои сопсашш8 0.1-1.0 тс8 оЕ РХА со а яиаП (0.5 тп1) писгоЕи8е сиЬе сопса(и!и8 0.3 )т8 оЕ а 1шеапкес) р!аяиЫ ш 1х г)ерЬоярЬогу1ас!ои Ьийег (е.8., р!)С с1еачет( тчтсЬ ВатН!).
роо! сЬе стчо яатр!ея оЕ раг6аПу 6!Кеятег! Кепоинс РХА йас сопсаш йе Ь!8Ьеяс атиоиися оЕ РЫА !и сЬе 38 — 52-14Ь гап8е. Ехтгасс йе роо1ег1 РХАя оисе тч(сЬ рЬеиоЬсЫогоЕогтп аиг) опсе тч!(Ь сЫогоЕогги. Кесочег сЬе РХА Ъу ясапг)агс( ргестрЬа6ои тч!(Ь ейапо1 аис1 яиЪяе- гртепС тчаяЬ!08 (и 70% еСЬаио1. Рьяо!че йе г)атр реПет оЕ РЫА (и 180 01 оЕ ТЕ (рН 8.0).
Кеягьрепяов ь Ьеяс ассошр1ЬЬед Ьу а11очап8 йе РЕ4А ре!!ес со яоа)г )в ТЕ очегш8Ьс ас 4'С. Ро пес чогсех сЬе РЬЕА. !пясеаг), тптх йе РЫА Ьу Еепс!у сарр!в8 сЬе яжея оЕ сЬе сиЬе (р1еаяе яее сЬе шЕогша6оп раве! оп М!Ы!М!Е!ЫС РАМАСЕ ТО ИКСЕ РЫА МОЕЕС()сЕ5 тв СЬарсег 2). !Е оп1у яша!! атпоипь оЕ РХА аге ача(1аЫе, ая Ь сЬе саяе ъчЬеп сопясплс6п8 сояпга !тЪгаиея Еготп Еотчеюгсед еи)гагуос(с сЬготпояоптея ог Еготв риг(Етет( уАСя, йеп, !вясеай о( есЬапо1 ргестриапов, рип(у йе РтеА Ьу игор гПа!уяь аяа)ттяс ТЕ (РН 8.0) чай Еоас)ттц шешЬтавея, ая г(еясг)Ьет) ш Рготосо1 5.
Ргососо! !г Соизггис6ои о( Сеиогигс РЛЕА Е4Ьгаг)ез ги Созгигг( Ъессогз 4.21 Ь. 5ес ир а зесопг! сои!го! (Ьас сопсашз 0.3 щ оЕ йе хаше Ппеапхес) р1аяпЫ сп 1О р1 оЕ 1х с1ерЬозрЬогу1а6оп Ьийег. Ро пос агЫ С1Р со 6из сопсго1. с. РоПоъч СЬе !пзггис6опз !п 5герз 14-16. !псиЪасе йе 1аг8е-зса1е с!ерЬозрЬогу!ас!оп геас6оп апс1 сЬе съчо сопсгоЬ Еог 30 ппписез ас 37'С. ТЬеп сгапзЕег сЬе сЬгее геасбопз со а ъчасег Ъай зес ас 65'С апс) спсиЬасе йеш Еог 30 ппписез со )пасс!часе С1р. 14.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
