Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 71
Текст из файла (страница 71)
ТЬеае р!аг!иеа аге йеп асгеепе6 а аесопсС 6ше Ьу ЬуЬгЫ1гас!оп. Р!сСг а а!па!е, егер-!ао1асесс роя!!че р1аг!ие Егогп йе аесопбагу асгееп апд аиЬсесс Ь со а66!с!опа! гоипба оЕ ьсгееп!па ипп0 сЬе а!ос!с ь пепе!!сас!у риге ап6 ечегу р!аоие ЬуЬпепгеа со с!се ргоЬе оЕ гпсегеас. сгае а р!ааааа 6егсчед Егогп сЬе Впа! гоип6 оЕ асгеешпа со гпа!се а асосЬ аа бекпЬе6 сп ргососо! 3 ог 4. Рго1осо! 23 Кар!с! Апа!уыил о1 Вас1епорЬаце Х! ю!аде~: Рипйса6оп о1 Х 0МА 1гот Р!аде ! уьа1еь члгч5ь ое Рком!5ачс се!чомбе ок СО!чА СЕОые5 оЕгеп Ье81па Ъу Й8еаг)п8 ш!п!Ргерагаг!опа оЕ Ьассег)орЬа8е ). РЬ)А ю)гЬ геагг)сг!оп епкушеа апг1 апа1уа!п8 гЬе ргойисга оЕ г!!8екг!оп Ьу а8агоае 8е1 е1есггорЬогеыы ТЬе !хо шегЬогЬ ргезепгег1 Ьеге апй ш Ргососо1 24 аге Еог гЬе гар!г! ргерагагюи оЕ япа11 ашоипга оЕ Ъасгег)орЬа8е г.
Е)Ь)А йаг аге аи)гаЫе Еог иае ав аиЪаггасеа Еог геьгг!сг!оп епгушеы ак гегпр!а!ей Еог Кй!А ьупгЬеыь гч1гЬ РЬ)А-дерепдепс К1)А ро1ушегааеь епсог!ег! Ьу Ьассег)орЬа8еь 5Р6, ТЗ, апй Т7, апд аь гешр!асек !и гЬе РСРс. ТЬ!а ргогосо! (Хи 1986) !а г)ея8пег1 Еог иае ъчгЬ Ъасгег!орЬа8еа ргерагес$ Егоги р1аге 1уаагеы гчЬегеаь Ргогосо! 24 шпиге ьи!гаЫе Еог Ъасгег)орЬа8еь 8готчп )и 1н)шг! си1гш еь (Еег!ег ег а1. 1977).
5ечега1 ойег арргоасЬеа аге ацпппаг1гег! ш йе рапе! оп АЕТЕКМАТ!ЧЕ РЕ!К!Е!САТ!О!Ч МЕТНОО5 аГ йе епс1 оЕ гЬ1а ргогосо1. ТЬе с1опеа а1ао гпау Ъе апа!улей яшр1у апг! йгесг1у ак г!еасг)Ьей !и гЬе рапе! оп А|чАЕТ5!5 ОЕ СТОЛ!Е5 Е!5!йО РС8 аг йе епг! оЕ йь ргогосо1. 1п 1агег сЬарсегя иге г!!ксиаа агЫ!гюпа! шей- огЬ гЬас сап Ье иаес! го апа1уге !иаегга с1опег! !и Ьасгег1орЬа8е 2. гесошЬшапгы ° Уесгогь висЬ ак 7 ХАР апд ) УлрЕох Ьаче Ьееп дея8пег! го а11огч шаг!а го Ъе гесочегес! апг! апа1)тес) аа р!алаш!г!а (Еог г!ега11ы р1еаье атее гЬе шггог!исгюп го СЬарсег 11).
ТЬ)а шегЬос1 ччог)сь ЪекГ ъч)ГЬ яиа11 шаегГа !<8 1сЬ) апс1 1а сЬ!еЕ!у оЕ ЬепеЕ1Г гчЬеп гесочег!п8 с!опес1 сЕ)ХА Егош Ъасгег)орЬа8е ) гесошЬ)пап!я ° 5ша11 !паегга а1ьо сап Ье гесочегег! Ьу ияп8 арес!а!!у йеы8пей гЬегшоагаЫе Р14А ро!ушегая еь го сага!ухе 1оп8-гап8е РСК !Еог с)еса118 р!еаье атее СЬаргег 8, Ргогосо1 13). ТЬ1а шегЬой !а Лег!чег! Егош гЬаг г1еасг)Ъей Ъу Хи ( 1986) апг! ъ аа ргочи)ес) Ьу Е)!апе !е11пе1с апд РарЬпе Вач)а !с)п!чегягу оЕ Техас 5оигЬ~чеагегп Мейса! Сепсег, Е)а!!ай). 2.101 2./02 СПаргег 2: Вас!ег/орЛагге 7. аггг/ Тгз есгогз МАТЕК!АЕо САЕ/Т1ОХг р!еазе зее Аррепс/!х 12 1ог арргорпасе Ьапс/1/пе оЕ гпа!епа!з гпаг/сес/ иИЬ <! >.
Вссггег8 апс! ьо!61!оп8 Р1еазе зее Аррепспх 1 1ог согпропеп18 о/ 81ос/с зо1и6опз, Ьппегз, апс/ геаееп18. Е61и1е зсос/с зо1и6опз со ЕЬе арргорпаге сопсепсга6опз. СЫого!огпг <1> Е/Лапо/ Н|ВЛ-заа ЪиГЕег 20 |пм Тпз-С1 !РН 7.41 1.0 М ХаС1 1 гим ЕРТА !РН 8.01 /зоргорапо/ 1оь -за а Ъийег 20 шм Тгь-С1 !РН 7.41 0.2 М ХаС! 1 |пм ЕРТА !РН 8.01 РПепо!:сЫого/огт /7:7, и/г/ <1> 5М ТЕ /рН В.О/ ТМ Мес!Еа ЕВ ог П/УСУМ аВагозе р/асез Рге|Ыу роигес/ р!асез /150-пип йашесег/ йас Лаге Ьееп еош1!Ьгасес! |о гоош сегпрегасше 81|ге сЬе Ьезс ге|и!ып йа гпейой А8агозе Ь рге/егге|/ со а8аг |п ог|/ег со пипипые сопсапипапь йас сап /псег/его и !й епхушаск апа1уяз о/ РХА ргераге|1 Егоп| р1асе 1узасез оЕ ЬассепорЬаае 7.
РХА. ЕВ ог /47СУМ сор аВагозе Рог с/оса!1з оп ияи8 сор а8агозе, р!сазе зее Ргососо! 1 оЕ й|з сЬарсег. А8агозе Ь рге/еггес/ со а8аг |п сЬЬ ргососо! ш огс1ег со пипипые сопсапипасюп зз!1Ь |пЬ|Ь!согз йас сап шсегЕеге ьчсЬ зиЬзес/иепс епхушапс апа!узь оЕ ЬассепорЬа8е. Сеп1г!Еще8 апс! Ко1ог5 5олгаВ 55-34 го/ог ог ес/ива/епс Ьресса! Ес!ссгргпеп1 Вого|В/|саге Раз/еиг р|реое Е!и//р-г/ со/итпз /5сЫе/сПег В 5сЛие/// рсга/ег ЪагЛ ог ПеастВ Ъ|ос/с ргезес со 47"С И|Пастап ОЕ52 РЕ52 Ь а ргерагасюп оЕ РЕАЕ-се11и!озе, ап апюп-ехсЬап8е геяп, |Ьас ь изес/ |и й|з ргососо! со гешозе Ьозс РХА ап|! ЕХА !гоги р!асе ог 11|/шс/!узасез.
А ргеячоИеп чегяоп о/ РЕ52 ь ача!!аЫе !гоги |А|Пасшая апс/ сеог1|з ехсеееВп81у зче!1 !и сЫз ргососо!. Рог еасЬ 150-гпп| р!асс 1узасе со Ье рш|Вес1, 10 ги! оЕ а 2:1 з1ипу оЕ РЕ52 ш 1.8 гпейогп Ь гес/и!гес/. Чес1огъ апс! Вас1егса! Ягасп8 ВассепорЛаВе 7., гесогпЬ|пап!, Вгоып аз з/пВ/е зге/!-/зо/асес/ р/ас/иез оп а !аггп о/ Ъас/ег/а Ргерагес/ аз с/езсг!Ьесс |п Ргососо! 1 оГ |Ь|з сЬарсег. Е, со/! р/а6пд Ьассепа Ргерагес/ аз с/езсг!Ьес/ ш Ргососо! 1 оЕ |Ь~з сЬарсег. МЕТНОО Ргерага11оп оГ !у8аГе8 !абае а Ьогоя!кате Равтеиг р|реое |о рк1с 8 — 10 счеП-!ао!атес! Ъас|епорЬа8е р1ас)иез Гготп а р1а|е с1епчес1 Ггот а ПепеПсаПу риге, р1ас)ие-рит|Т|ес( ЪасгепорЬаце яос)с.
Р1асе йе р1ас)иеа т 1 т1 оГ 5М апс) 50 1|1 оГ сЫогоГопп. йоге |Ье аиарепяоп Гог 4 — 6 Ьоитх а| 4 С со аПосч |Ье Ьас|епорЬа8е рагпс!еа |о с)1ГГиае Ггот |Ье |ор а8агоае. 1п а япаП, етеп!е си!|иге |иЬе, ппх 50-100 р1 оГ |Ье ЬастепорЬа8е аиарепяоп (-!О' рГи) сч1|Ь 150 р! оГ р!аПп8 Ьас|епа. 1псиЬа|е |Ье |пГессес1 си1|иге Гог 20 т!пи!ее а| 37"С. АсЫ 7.0 тп! оГ тоЬеп (47'С) |ор а8агоае (0.7%), апс) ьргеас) йе Ъас|епа1 аиьрепяоп оп |Ье аит(асе оГ а ГгеаЫу роше|1 150-ппп р!а|е сои|а!п|п8 Ь)7СХМ а8агоае.
1псиЪа|е |Ье 1пчег|ес) р!а|е а| 37'С ип|П |Ье р1ас!иеь сочег а!пюя |Ье епПге ьигГасе оГ |Ье р!а|е (7 — 9 Ьоига). Ро по| |псиЬа|е |Ье р1асеь Гог |оо !оп8, о|Ьегчс!ее сопйиепс !уые сча! осси|, ъегасЬ тес)исеыЬе у!е!с! оГ Ъас|епорЬа8е РЬ|А. А|Ы 7 т1 оГ ТМ сПгес|1у опто |Ье аиг(асе оГ йе |ор а8агоае. АПотч |Ье ЬастепорЬа8е рагп- с1еь со е!и|е с!ипп8 4 Ьоигь оГ !псиЬаПоп а| 4'С сч1|Ь сопьгапп Пепг1е аЬаЫп8. Тгап|Гег |Ье Ьас|егюрЬа8е Л е)иа|е |о а сеи|при8е |иЬе, апс) теточе йе Ъас|епа! с!еЪг!х Ъу сеи|пГи8а|юп а| 4000ч (58,000 грт !и а 5огчаП 55-34 того|) Гог !О т)пи!ее а| 4"С. А яиаП а!киот оГ с1еагес! 1уаате сап Ье ает ааЫе а| |Ь!х атер аа а Ьас|епорЬа8е яосК ао1игюп. йоге йе атос)с а| 4'С очег а япаП чо1шпе оГ сЫого1опп.
Р(арепае !О т! оГ а 2:1 а!иггу оГ РЕ52 геяп !п|о а сепспри8е |иЬе апс1 аесПтеп| |Ье геяп Ьу сеп|при8аПоп а| 5008 (2000 грт 1и а 5огчаП 55-34 гогот) Гог 5 т)питеа а| гоо|и |ет- рега|иге. Кеточе йе я|регпа|ап| Ггпу |Ье геяп реПег апс! Р1асе |Ье септг|Ти8е |иЬе оп ке. Кеаиарепс) йе РЕ52 1и |Ье с1еагес) ТМ апс! аПои |Ье Ьас|егюрЬа8е рагс!с1еа |о аЪаогЬ го |Ье геяи Ьу госЫп8 |Ье сеп|пГи8е шЪе Гог 3 ттпитеа а| гоот |еп|рега|иге. Септг|Ти8е |Ье ТМРРЕ52 а1иггу ас 4000|| (5800 грт |п а 5огчаП 55-34 го|от) Гог 5 пипи|ея СагериПу сгапаГег |Ье аирегпагапс |о а ГгеаЬ сеист|Ти8е |иЪе апс! гереас |Ье сеп|при8а|юп яер.
Р)асагс! йе реПе| а(гет еасЬ септпГи8атюп. ТгапзГег йе аирегпатапт Ггогп йе ьесопс! сеи|при8апоп |о а ГгеаЬ сеитпГи8е |иЬе. Ех|тас| |Ье я|регпа|ап|, счЬьсЬ сои!а)па |Ье Ъас|епорЬа8е Л ратпс!ея опсе сч!|Ь РЬепоЬсЫого- Гопп. ТгапаГег йе ас)иеоиа рЬаае, ъчЬ~сЬ сои!а)па |Ье Ъас|егюрЬа8е Л Р14А, со а ГгеьЬ ро!ургору- !епе |иЪе апс1 асЫ ап ес)иа! чо1шие оГ !аоргорапо1. йоге |Ье пих|иге Гог 10 пипитеа ас — 70ОС, 10. СоПес| |Ье ргес|р||а|ес1 Ьас|епорЬа8е Р)с)А Ъу сеп|при8апоп а| !6,500|г (12,000 грт 1и а 5огчаП 55-34 гогот) Гог 20 т!питез а| 4 С. Рта|и йе )аоргорапо! Ггот йе сепспГиПе |иЬе апс1 аПо|ч |Ье реПе| оГ РЬ(А |о с)гу т а|г.
Кес)1ььо!че |Ье РЬ)А реПе| 1и 2 т1 оГ !о|ч-за1т ЬиГГег. Рта|оса! 23: КарЫАпа!уттз оГВастет)орЬа8е Л Бо!атея Рит((|сот!ои оГЛ Р(чА Гтот Р!а|е йутатет 2!03 2.104 СЬаргег 2л ВасгегЕорЬа8е 7. апаг 1)л Уеггогл 14. РиПЕу (Ье ЬаслепорЬа8е Р)ъ)А Ьу сЬготало8гарЬу оп ап Е|ибр-с1 со1шип: а. Е)ее а луг(п8е го риаЬ 1-2 гп! оЕ Ь|ВЬ-еа1( ЪиЕЕег (Ьгои8Ь йе Е)иг!р-л) со1шип. Ь. РиеЬ 5 т! оЕ 1оъч-ха1( Ьийег ЛЬгоиВЬ ГЬе со1шпп. с.
АиасЬ йе 0.45-рт рге61(ег Го ГЬе со1шпп апс) 51оъч1у риаЬ ГЬе РЫА хатр!е (5(ер 13) (ЬгоиВЬ (Ье со!шпп. г!. К!пее (Ье со1 шип ъч((Ь 2 — 3 пл1 оЕ 1ои -еа1( Ъийег. е. Кеплоче (Ье рге61(ег апс) е!ше йе Р)ъ|А ъчЬЬ 0.4 гп1 оЕ ЫВЬ-аа!с ЬиЕЕег. Со11есс йе е! иасе а( йга е(ер |п а 1.5-гп1 т!сгоЕи8е ГиЬе. 15. Ас(г) 1 т! оЕ е(Ьапо1 со (Ье ею!и6оп оЕ е!и(ел3 Р)ъ)А, (пчегс (Ье ыЬе хечега! липея апс( шсиЪаге (Ье пихшге оп ке Еог 20 пипи(ею Со!1есс йе ргес(р)(а(ег( Р)ъ)А Ъу сеп(66л8а6оп ил а писго6л8е, г))есагл! йе ялрегпа(ап(, апг( Пил (Ье ре!!е( оЕ Р)ъ)А чг!(Ь 0.5 т! оЕ 70% е(Ьапо!. Р(есагл) йе аирегпагапг апг) а!1оъч йе ре!1ес оЕ Р)ъ)А (о л(гу !п (Ье а!г. РЫао1че (Ье ре11ег оЕ Р)ъ)А ш 50 р1 оЕ ТЕ (рН 8.0). Келилрепс) (Ье 1|НА Ьу ларр|п8 оп гЬе яс|е оЕ ЕЬе гиЬе.
Тгу ло ачоЫч оггехт8.!Е йе ОНА ргочел е618си!л го л()ыо)че, |псиЬаге йе шЬе |ог 35 пшшлел ал 58'С. ЕЕ шшлргерагаиом аге ъчог)г)п8 ъчеП, ехресг ло Ьо!але -5 и8 оЕ рог)Елел) ЪаслегюрЬа8е О)чА Егопл 5 х )Оле лпЕесгюы рагис!ея |л ь ролл(Ые ло елиплаге йе 9иапг(лу оЕЬаслепорЬа8е Р)ъ)А ргеьепг |и а р!але !уъаге ог 339ши си(лиге 1улале Ьу еПгесг а8аголе Пе! е1ессгорЬогеял (р1сале лее Ргошсо! 7). Рог геллпслюп апа|уял апг3 а8аголе Пе1 е!еслгорЬогеял, е68елл а 5 — ) О-)л! а)39иог оЕ йе гелилрепг(- ег) ОНА. |Е гЬе РНАе аге геяллапг го с1еача8е, ггеаг ЕЬепл ассоггКп8 со ЕЬе ше(Ьог( г)еесг)Ьег) оп ЕЬе ЕоПоъчш8 ра8е ш АОО(Т)О(ъ(АЕ РКОТОСОО КЕМОЧ(НС РОЕТ5АССНАК(ОЕ5 Ву РКЕС(Р(ТАТ(О)ъ( (Аг(ТН СТАВ.
АЕТЕК)ъ)АТ1ТЕЕ РЕ)К1Е!САТ)О)ъ( МЕТНО05 Нипг)гес(е оЕ г(|ЕЕегеп( те(Ьос)е аге л(еесг(Ьег) |п ГЬе 33(егагиге ло ргераге ьгпаП агпоипге о1 ЬасгепорЬа8е ), 0)хА 1гогп р|аге (уьагех ог )к(иЫ сиКигея Мое( о( ЕЬеее аге пл|пог напаиопа ог е|аЬогаиопа оЕ йе Ьаяс ГесЬп(г(иех деаспЬес! )п (Ыь рго(осо!. ТЬе Ьно ргоЫете йа( аг)ее тоел Егес|иепг|у аге роог у!е)сЬ оЕ ОНА апс! ап (паЫП(у го с(еане йе 05)А ън)(Ь геелпк Поп епхуплея Ах с|ьсихаес(, (Ье Е(гег оЕ (Ьеее ргоЫегпе 35 Ьеег гю!нег! Ьу ехрепгпеп6п8 гМй йе гаПое о1 ЬаслепорЬа8е Го Ьое( сеПе ъчЬеп хеи(п8 ир йе р|але (уха(ее ог!к|иЫ си|гигея ТЬе аесопс|, ъчЫсЬ 35 гпоге соплгпоп|у епсоип(егег( гМй р|аге )уха(ее гайег йап (к(иЫ си!(игея (а ойеп саиеес( Ьу ро|уеассЬагЫе |пЫЫгогх г(ег)нег( (гоги йе Ьое( Ьасгег(а апг()ог (Ье а8аг. ТЬ~е ргоЫепь сап хотел)тех Ье ео1чел( Ьу иа)п8 а8агоее ог а8аг Еплпь а г((Е(егеп( гпапи(ас(игег ог Ьу аиЬе(3(ил(п8 а8агоее Еог а8аг |п (Ье гпег(3- игп иаес( го роиг йе р!а(ея 6 йе ргоЫепл рега!5(я йе Ьея соигее оЕ асиоп 35 ло иае а гпоге е3аЬ- огаге асЬегпе го рип(у йе Ьассег(орЬа8е раи(с)еь апс| йе Ьасгег)орЬа8е 0)ъ)А.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
