Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 162
Текст из файла (страница 162)
ЧlавЬ йе со1шпп яч(гЬ згеп1е 1х со!игпи-1оад(пц Ьн(Тег (д(1нге Егот 2х ягос1с ня(иа пеп!е ОЕРС-ггеагед Н О) нп61 гЬе РН 01 гЬе е(йнепг (ь <8.0, Бзе рН рарег Гог гЬыпеаьнгегиепг. 716 СЬаргет 7: Бхггасггоп, Риггфсаггоп, аигЕАпа!уы оЕтгг!чЕАЕгот Еи)сагуоггс Се!!х Е518801че гЬе К!ч!А 1п г)оиЫе-г)1810!ее), аигос!аней Н О, апг1 Ьеаг йе аоЬлПоп го 65"С Еог 5 пнгипея Соо1 гЬе хо!иг)оп го гоогп гегпрегагиге г)шсИу, апг! агЫ 1 чо1шие оЕ 2х со1шпп1оас)!пав ЬиЕЕег.
Неаии8 гЬе КГ4А 8!чгиргч ге8юич оЕ чесоигЕагу ягисшге йаг ш!8Ьг !ичо!че гЬе ро!у!А! га!!. рог КЬГАь гЬаг соигагп !аг8е ашоиигь оЕ чесоиг!агу чггиссиге, гЬе !ис1ияои оЕ йшегЬу!чи!Еох!гЕе !ЕгМ5О) аг г0% !н)ч) ги гЬе со1шпп-1оайи8 Ъийег гиау ииргоче гегепгюи аиг! ьиЪьег!иеиг гесочегу. ТЬе чоа!шп ча!г оЕ !аигу! аагсояпе ь ге!аиче!у гпю! иЫе аиг! гиау гЬегеуоге ппрегЕе гЬе йогч оЕ гЬе со!шии !Е гЬе гооги геигрегашге Ь !еы гЬаи г8'С. ТЬЬ ргоЫегп сап Ье ачо!г!ег! Ъу ияп8 ЫС! !пчгеае! оЕ Нас! иг йе со!шии-!оайи8 ЪиЕЕег. Кесочеппе Ро1у(А)+ КМА Егогп 1Ье Со1пгпп Арр!у йе ао!шюп оЕ К!ч)А го гЬе со1ишп, апс1 игипегйаСе1у Ьерп го соПесг 1п а хгеп!е гиЬе ЕЬе шагейа1 Почч)пу гЬгоииЬ ЕЬе со1шпп.
Ъй~еп аП оЕ гЬе К!х!А хо1игюп Ьаа епгегег) гЬе со1- шпп, гчааЬ гЬе со!шпп чч)гЬ 1 со1шпп чо1шпе оЕ 1х со1шпп-1оагйпц ЬиЕЕег шЬг1е сопг)ишь го соПесг йе Йочч-гЬгощЬ. 'ччЬеп аП йе 1щшс) Ьаа егпегКес) Егош гЬе со1шпп, Ьеаг йе соПессес) Понг-гЬгоииЬ го 65'С Еог 5 пипигеа апс) геарр1у Ь го йе гор оЕ гЬе со1шпп. Ада)п соПесг йе гпасепа1 Поиипа ЕЬгоицЬ гЬе со1шип. Си!!!се гиаиу сЬгогиаго8гарЬу геяия о!!8оЫТ)-се!!и!оае иеггЬег яче!!ч ччЬеи Ьуйгагег! иог сгас!гк иЬеп «!гу.
ТЬеге !ч ио иеее! го гиагиса!и а Е!ои оЕ !гциЫ гЬгои8Ь гЬе со!шип ог со !геер гЬе гиаспх г!агар. ЪЧахЬ гЬе со!шип иг)ЕЬ 5-10 со1игпп чо1шпех оЕ 1х со1шпп-1оаг!!пав Ьийег, соПесг)пК 1-гп! Егасгюпх гпго пеп!е р1аьпс гиЬех !е.ц., гп)сгоЕице гиЬех). 1и чоше ргоюсо!я ЕЬе со!шпп Ь ыачЬег! чч!гЬ 5 со!шии чо!игпеч оЕ !х со!шии-!оайи8 ЪиЕЕег соисагши8 О, ! м Ыас! апег 5гер 7. Ногчечег, чегу !!гг!е ог по иоиро!уаг!еиу!аге8 КМА е!игеь Егоги гЬе со!шии г!иг!и8 ЙЬ ччачЬ, йЬ!сЬ саи гЬегеЕоге Ъе опиией Т)хе г!иаггк ог 61хрохаЫе гпегЬасгу!аге синессеа го шеахиге йе аЬьогЬапсе ас 260 пш оЕ а 1:20 сП1ипоп оЕ еасЬ !гасГюп соПесГег) Егош ГЬе со!шпп их)пК 1х со1шпп-1оаг!!пав ЬиЕЕег аь а Ыап1с. А чо!шюп соигаю!и8 ЗВ Гг8/гп! КХА чч! ! 8гче ап аЪчогЪаисе геайи8 оЕ !.0 аг 260 иги апг! а геай ш8 оЕ 0А-0.5 аг 280 иги. !шиаПу, гЬе Оуггю ии!! Ье чегу Ь!8Ь ач гЬе иоиро!уаг!еиу!аге8 КЫА раяеч гЬгои8Ь гЬе со!шии. ТЬе!агег угас!!оич ьЬои!г! Ьаче негу !гп!е ог по аЪчогЪаисе ас 200 иш.
Е1011пе Ро!уЕА)+ К)ЧА Егогп 111е Со1оп1п Е1иге гЬе ро1у(А)+ К1ч!А Егопг йе 01фо(г!Т)-сеПи!оье ччПЬ 2-3 со1игпп чо!ишех оЕ хгеп1е„ Крахе-Егее е!иГюп ЬиЕЕег. СоПесг Егаспопа ег)шна!епг гп яхе Го 1!3 Со 1Е2 оЕ !Ье со1шпп чо1- шие. 10. !3хе г!иаг!х ог йхрохаЫе гпейасгу1аге сичепех го гпеахиге гЬе аЬхогЬапсе аг 260 пш оЕ еасЬ !гаспоп соПессег) Егогп ЕЬе со!шпп.
Роо! йе Егасйопх сопса)п)пц йе е1игег1 КХА. Ргесгрпаге гЬе Егасгюпв сои!а)п)пц а гпа!огпу оЕ гЬе ОР гпагепа1 Ьу гЬе агЫ)гюп оЕ 2.5 чо1шпех оЕ егЬапо1. ТЬгв зо-са!!ег! ро!у!А) КМА Ь а шери! сопгго! ги чиЪчеоиепг ехрегииеигя Рго1осо! 4 5е!ес6оп о1 Ро!у(А)+ КМА Ьу Ва1сп СЬгота1оцгарЬу нен мачт КМА 5АМР(е5 лке то ве Ркосе55е0 ог хгЬеп ггог)с!па ебй агпаП апюппга (<50 )гВ) оЕ госа1 гпапппа1гап КХА, йе гесЬп!с)пе оГ сЬогсе 15 ЬагсЬ сЬгогпагоагарЬу оп обао(с)Т)-се1- !п!ове. ТЬе гпе(Ьос( 15 сагг(ес) оп( гс)ГЬ а 6пе Вгас)е оу о!1Во(с)Т)-се11п!оае а( ор6гпа1 (егпрега(егер Еог Ь!п6!пВ апс) е!пгюп.
Мапу гпе(ЬосЬ Еог рппбса6оп оЕ ро1у(А)+ КЬ)Аа Ъу ЬассЬ сЬгогпагоВ- гарЬу Ьапе Ьееп рпЫ!5Ьес) опег (Ье уеагя. ТЬе гесЬп)с)пе с(еясг(Ъес( Ъе1оге 15 а птос)!6саг!оп оГ йе гпегЬод оу Се1апо ет а!. (!993). Рог ас)йг(опа! гпе(Ьос)5, р1еаье аее ГЬе рапе1 оп А00!Т!ОЫАЕ МЕТНО05 ТО 5ЕЕЕСТ РОЕТ(А)+ КЫА Го!1окбпВ 5(ер 15. МАТЕК!АЕ5 А !МРОКТАНТ Ргераге аП геааепга иаес) (п (Ь)а ргогосо! вл(Ь ОЕРС-ггеагес! Н О (р!еаае аее йе (п(огтаггоп рапе! оп НОЧ( ТО И(ПЧ ТНЕ КАТТЬЕ И(!ТН КЫА5Е).
СА0Т!ОЬ): Р!еаае аее Аррепспх 12 (ог арргорпа!е Ьапг)ппд о( тагепа15 шаг(сег( гг!(Ь < ! >. Впйег5 апд ао!66оп5 Р1еаье аее Аррепспх 1 (ог согпропеп!а о( ь(ос(с ьо!ипопь, Ьипегь, апг( геаКеппи 01!и(е а!ос(с ьо1ипопа !о йе арргорг!а(е сопсеп!га(!опа.
АЬьогрпол/гпаиЬ!пд Ьийег ТЬ1а Ьпйег 6 ТЕ5 сопга!пшел 0.5 м НаС!. Агпгпоп(игп асе(а(е (10 М) <! > Ейапо( (се-со(с( гпа(ег ХаС( (5 м) ТЕ5 Ь(пс!е!с АспЬ апг! О!!коппс!еоЕ!е!е5 КХА, (о(а( Ргерагеа аа оеасг)Ьес( ш Ргососо! ! аг 2 о( ГЬ!а сЬарьш йрес!а! Ег!и!ргпепЕ Сипеиеь (ог теаьиппК аЬяогЬапсе а( 260 пгп 7. 18 Ртгосо! 4: $е!есйоп оЕ Ро!у(А) в ЯМА Ьу ВанЬ Сйготаго8горйу 7.19 С!ве с!ЬроваЫе сЛ|-сгапврагеи| гоесЬасгу!а|е сичеиев ог в|вас!ам 9иаг|а саче|сев.
Ве(оге аисС айег иве, воа!с с!иагсг сичеиев |и сопсепнасей НСЬи|есЬапо! (|: |, ч!ч) Еог а| !еав| 30 гшпосев аосС |Ьеп |чавЬ ехсеияче!у !и всеп1е Н О. МЕсгоуиде Е!ссес! вч!сй вреес! сои!го! О!!Во(с(Т) | в-зо се!!"!'|ве Ове Туре !!! се!!и1ове (Ъ!п|С!и8 сарасиу 100 ОСЛ /8) е|!|й!!Ьга|ед !и аЬвогрс|оо!|чавЬ|пй Ъийег аис! выреойей |а сЬе вагпе Ъийег ас а соосеп|гас|оп ос!00 тййп1. рог |Сесайв, р!еаве вес ргососо! 3, Мерв ! СЬгооВЬ 3. когассп8 ийее! Ига!ее Ьайв ргевес со 55"С аис! 65'С МЕТНО0 1. 1и а вепев оЕ всеп1е писгой8е сиЬев, ас1!ивс сЬе чо1шие оЕ еасЬ ватр!е оЕ соса1 К)4А (ир со 1 п|8) со 600 )с! ъч(сЬ ТЕ5. Неас сЬе веа1ес( сиЬев со 65'С Еог !О пиписев аи|1 йеп соо! йегп с!шсИу ш ке Со 0"С, АсЫ 75 )л1 (0.1 чо1игпе) оЕ 5 м ХаС! со еасЬ вагпр1е. 2.
А|Ы 50 гп8 (500 )|1) оЕ ес(ш11Ьгасес( оП80(с)Т)-сеПи1ове со еасЬ тЬе апс( 1псиЬасе сЬе с!овес! СиЬев оп а гогагш8 вчЬее! Еог 15 иипиСев аг гоо|п Сегпрегагиге. 3. Сепспйл8е йе сиЬев ас 600-8008 (-1500-2500 гргп) Еог 2 пиписев ас гоогп сетрегасиге т а писгоййе. 4. ТгапвЕег СЬе вирегпагапСв Со а вепев оЕ 6 ееЬ гпкгоййе СиЬев. йоге СЬе СиЬев оп ке. 5. То сЬе реПеь оЕ оП80(с!Т) геп|а(п(п8 1и сЬе Пгвс вес оЕсиЬев, асЫ 1 т1 оЕ ке-со!д аЬвогрс(оп!ччавЬ(п8 Ьи((ег. Тл(врегве сЬе реПеь оЕ оП80(с!Т) Ьу 8епс1е чопех|п8.
1исиЬасе йе с!овес( шЬев оп а госайп8 лчЬее! Еог 2 пиписев ас гоо|и сетрегасиге. 6. Сепгг(Еи8е СЬе СиЬев аС 600 — 8008 (-1500 — 2500 грп|) Еог 2 пипи!ее аС гоот СетрегаСше 1и а т)сгоЕи8е. Е31всагсс йе вирегпаСапСв апс( йеп гереаг 5герв 5 апс( 6 Слчке. 7. Кевиврепс1 йе реПеь оЕ оП80(с(Т) 1и 0.4 п|1 оЕ |се-соЫ, с1оиЫеяПвсП1ей аисос1ачес1 Н,О Ьу 8епС)е чогСехш8. !пииесПаге1у сепгпй8е йе СиЬев Сог 2 пипигев аС 4'С |и а писгой8е. 8.
Кепюче йе вирегпасапсв Ьу сагей! авр|гайоп. 9. Кесочег йе Ьоиис( ро!у(А)+ КХА Ьу геялврепсПп8 йе реПеь оЕ о1|8о(с1Т)-сеПи1ове |и 400 р1 оЕ с)оиЫе-с(1всП1есс, атос!ачес1 Н О. 1псиЬасе йе виврепяопв Еог 5 пиписев ас 55'С апс1 сЬеп сепспй8е сЬе сиЬев Еог 2 пиписев ас 4'С |п а писгой8е. 10. Тгапв(ег йе вирегпасапь со а вепев оЕ ЕгевЬ сиЬев апс( гереас 5сер 9 слчке, роо1ш8 сЬе гесочегес1 вирегпасапся 11. АсЫ 0.2 чо1шпе оЕ 10 м аиипопшт асесасе апс( 2.5 чо1шиев оЕ есЬапо1 со йе вирегпасапсв. йоге сЬе сиЬев Еог 30 ииписев ас — 20'С.
12. Кесочег йе ргессрссасес( ро!у(А) ' КХАв Ьу сепспй8айоп ас гпахипши вреес( Еог 15 т)посев аС 4'С ш а писгой8е. СагейПу с!1всагс) йе вирегпагапйь ап|1 лчавЬ СЬе реПеЬ (вчЬ(сЬ аге ойеп |пчЬ|Ые) ъчКЬ 7096 е|Ьапо1. Сепспй8е Ьпейу, гепюче йе вирегпасапсв Ьу авр|гасюп, апс1 всоге йе ореп сиЬев ш ап шчегсес( роясюп Еог а Ее|ч пипшев со аПо|ч гповс оЕ сЬе гевЫ- иа! есЬапо1 со ечарогасе. 13. ЕЛ(вво!че |Ье КХА |п а яиаП чо1ите оЕвгеп!е ЕЛЕРС-Сгеасес( Н О.
14. Евс(тасе |Ье сопсепсгайоп оЕ йе КХА ав с(евспЬес! (и АррепсПх 8. 15. 5Соге йе ргерагайопв ав с(евспЬес) ш йе рапе! оп 5ТОКАОЕ ОР КЫА |п РгоСосо! 1. 720 СЬаргег 7: Ехпаспоп, Ригфсас(ол, алдАла1уеи о) тКЬ(А)гот Еи)гагуос(с Се|0 АО01Т1ОЬ(АЕ ИАЕТНОЮБ ТО 5ЕЕЕСТ РОЕТ(А)+ КЬ)А Ь(апу а|сегпасЫе тедсоде со ойцо(дТ) сЬготасоцгарЬу Ьаче Ьееп деч|еед очег сЬе уеаге со ье)есс ро)у(А) гпКХА (гот ргерагас!опь о( со1а| КЫА. ТЬеье гпейсоде (пс(иде 1Ье сойонч(пц: ° СЬготасодгарйу ол ро(у(Е рйерйагояе (ЫпдЬегц апд Регаеоп 1974).
ТЬе адчапсаце оС 1ЬЬ сесЬпк(ие 'ь сйа1 ЙЧА гпо)оси)еь мг)сЬ еЬогс ро|у(А) сайе мчй Ыпд е6с(епс)у со сйе!опц ( — 100 пис1еос!де) ро(у(Е)) сЬа(ия аиасЬед 1о 1Ье 5ерЬагоье. О|яадчапсацеь о( сЬе гиесЬод |пс!ис|е сЬе соп|рагасве!у )очн Ыпсйпц | сарас1(у о( ро)у(Е))-йерЬагоее апс| (Ье песеее|(у оС ие)пц (огтагп!де-Ьаеед Ьи((его со е!Ые СЬе Ьоипд ро!у(А) КХА ей|с1епс(у 1гогп СЬе |опц ро(у(Е)) сЬа|пк | ° )мрет 61(его со и Ьгсй ро)ус Е)7 ееьюдиеь аге сача!елду а(гасйед (НнгеесЬпег апд НетЬегц 1984; )асоЬеоп ' 1987). То1а| сеИи|аг КЬ(А |5 5роиед оп1о 1Ье й!сегь, м4ъсЬ аге 1Ьеп мгаеЬед |и ОЕРС-Сгеа1ес| 0.1 М НаС( апд 70% е(Ьапо|.
Ро1у(А) КХА |е е|и1ег| Ьу Ьеайпц СЬе й!сегь со 70'С 1ог 5 т!посев |и Н,О. ТЬеье й!сегя Ыпс| ир со 20 Рц о( ро|у(А)' КМА(стс апс| аге ехсгеп|е!у окей|1 ъчЬеп 'ьо3ас|пц ьтай атоипсе ос ро|у(А)' КЬ)А (гоги псапу еатр)еь ь)гпи!сапеоие)у. ° 5(гор(ач(д(л-соа(ед рагатацледс роlуе(уееле Ьеаде (А)Ьгесееп ес а|, 1990; Ногпея апд Когелет 1 990; | )айоЬееп ес а|. 1990).
ТЬеье Ьеаде (ачайаЫе Сгогп Ргогпеца апс| о(Ьег виррйегя) Ьаче сЬе аочапсаце 1Ьас тКЬ(А сап Ье сйгесс!у ||ю!асед (гоги!уь(а Ьи((егк соп(а(п(пц циап||йп|игл 'ьойчосуапа1е, |п а сур|са| ехрег'пиеп1, 1|хеие, се|Ь, ог сей еиьрепьюпя аге )умед м41Ь циапкйп|игп СЫосуапа1е, апс| а Ьюйпу|аСес| ойцо(дТ) рпгпег |е аодес| д!гесС!у 1о 1Ье )ужасе. А(сег а еЬоп реиод ос йп|е 1о айо|ч ЬуЬпдааСюп о1 1Ье рппсег со сЬе ро!у(А) сайь о( се|ййаг гпКХАь, гпацпейхед ЬеасЬ со м ЫсЬ ясгерсан(д(п Ьае Ьееп соир|ед аге аддед со 1Ье !ужасе.
ТЬе есгерсач)д!п сарсигеь сЬе Ыойпу|асес1 ойцо(сП) — ро|у(А) н тК34А сотр)охи апд а(йхеь СЬегп со Сйе гпацпейхес1 ЬеасЬ. А тацпе1 'ь 1Ьеп иьед 1о ге1пене дсе Ьеаде (гот СЬе!уьаСе |ю|исюп апс1 со (асй|сасе маеЫпц о(1Ье ЬеасЬ сч!1Ь а Ь|цЬьа)с ео(ис(оп, |и айпа! осер, сце ро)у(А) тКМА ь ге)еред (гоги 1Ье ЬеасЬ смсЬ Н О апд 1Ьеп сойессес1 Ьу е(Ьапо) ргес!р|сас!оп. ТЬе у|еЫ о( ро1у(А) гпКЬ)А 'ьо|а1ед м(1Ь Ьеаде Ь ес(иа) со ог ехсеесЬ сйас оЬ(апес3 Ьу сопчепсюпа| ойцо(дТ)-сейи!оке сЬгота1оцгарЬу. Атопц сЬе аднапсацеь о((егед Ьу 1Ьеве ЬеасЬ аге ьреед ос орегасюп апд сйе роек(ЬИ|су о1 мог)с)пц а1 й!пес)с сосем с1оье со дсоье оссигппц |и (гее ео)исюп.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
