Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (522940), страница 158
Текст из файла (страница 158)
7.2 Сйаргег 7: Ехггасйоп, Ригфсаг(оп, апдАпа1угй о!'тКХА Вот ЕиЕагуог)с Сейе А тчо!слг млммлилн сн.г сонтл!н5 -!О-' рц ог КЬ)л, 80 — 85% ог ччЬ~сЬ !а НЬоеогпа1 КХА (сЬ!ейу йе 285, 185, 5.85, апд 55 прес)еь). Моаг ог гЬе геташгпц 15 — 20% сопяага ог а чаг!егу ог !огч-то1еси!аг-юе!цЬг арес!еа (е.ц., ггапеГег КХАа апд япаП пис1еаг КЫАь). ТЬеее аЬипс1апг Кое аге ог" дейпед яге апд еес)иепсе апд сап Ье !ао1агед ш Ыгшайу риге Тост Ъу це1 е1есггорЬогеяя с)епягу цгасйепг сепгг!гицаг!оп, апюп-ехсЬапце сЬгогпагоцгарЬу, ог Ь!ВЬ-реггогтапсе 1щи!д сЬгогпасоцгарЬу (НРЕС). Ву сопггаег, тееаепцег КЬ)А, ччЬ!сЬ та)сее ир Ьегхееп 1% апд 5% ог йе гога1 сейи!аг К)ч)А, !а Ьегегоцепеоиь ш Ьой яге — ггогп а геъч Ьипйед Ьаееь го гпапу Ы1оЬавеа !п !епцй — апд аес)иепсе.
Ноыечег, тоба! еи)сагуог!с тКХАь саггу аг гЬе)г 3' сегпит а !гас! ог ро1уас1епу1к асЫ геа!диеа гЬаг !а цепегайу 1опц епоицЬ го айоьч тКХАа со Ье рипйед Ьу ай)п!гу сЬготагоцгарЬу оп ойцо(дТ)-сейи1оее. ТЬе гееи11!пц Ьесегоцепеоиа рори!айоп ог то!еси!еь сойесг!че1у епсодеь ч!ггиайу аП ог йе ро!урерг!деа еупгЬеа!хед Ьу йе сей. Весаиее НЬоье геядиеь салу Ьудгоху! цгоира ш Ъой гЬе 2' апд 3' роягюпя КХА (а сЬеткайу пшсЬ тоге геас6че йап Т)ХА апд !е еаьу ргеу со с1еачаце Ьу сопгапипаипц КХаьеа— епгутеа кдгЬ чаг!оиа зресгйсйгее йаг аЬаге йе ргореггу ог" Ьудго!ух!пц сйеегег Ьопда!гпЫпц РЬоарЬаге апд НЬозе геядиея Весаиае КЫааеа аге ге1еаеед й от сейь ироп 1уяз апд аге ргеаепг оп йе аЫп, сопьгапг ч!цйапсе )а гег)и!гед со ргечет сопсапйпагюп оГ 81ааеччаге апс1 ЬепсЬ горь апд йе цепегагюп ог КХаее ш аегогю1я ТЬе ргоо!оп !а сотроипс1ес1 япсе гЬеге !а по ятр1е тегЬос1 го шасггчаге КХазея Весаиее ог" гЬе ргееепсе о( шсгасЬа)п д!аи!йде Ъопдя гпапу КХааее аге геяегапс го рго! опцес1 Ьогйпц апс1 пи1д депагигапь апс1 аге аЫе го ге(о1д с)икЫу гчЬеп с1епагигес1.
()пй)се гпапу 13!ч(аеея КХаеее до пог гег)и!ге д!ча1епг сагюпе Гог ас6чйу апс1 йы саппог Ье еая!у шас6чагес1 Ьу йе !пс1ияоп оу ейу!епесйапипегеггаасе6с асЫ (Е)3ТА) ог ойег тега1 юп сЬе!а!ось гп Ьийег ео1ийопя ТЬе Ьевг тчау го ргечепг ргоЬ)епь чч!гЬ КЫаье !а го ачоЫ сопгапипа6оп !п йе йгаг р1асе (р1еаае аее гЬе 1п(оста!!оп рапе!а оп НОчч ТО чч!Х ТНЕ ВАТТЫ ЪЧ!ТН ВНл5е,! НН!В!ТОВ5 ОГ ВНлхея апд 0$ЕТНУЕРУВОСЛКВОХЛТЕ аГ йе епд ог гЬ(е сЬаргег). ТЬ!а сЬаргег !а сйчЫес1 !пго гччо раяе (р1еаье атее Р!циге 7-!). ТЬе йгаг ьепее оГ ргогосо1а (Ргогосо1а 1 гЬгоицЬ 6) )а с1ечогед со гЬе !ао!аг!оп апд рипйсагюп ог" гога1 КХА апд, аиЬеес)иепг!у, ог ро1у(А) КХА. ТЬе аесопд вепеь ог ргогосо!з (Ргогосо1е 7 гЬгоицЬ 12) деа1а кдй чапоиь арргоасЬеь !ог гЬе апа1уа!а ог" рипйед К)ч)А, !п рагбси!аг Гог аааеьа!пц цепе ехргеаа!оп апд!ог цепс ягистге.
НуЬпйхайоп Ьу погйегп ггапагег (Ргогосо1а 7 апс1 8) ог Ьу дойа1ог Ыогг!пц (Ргогосо1 9) тау Ье иаед со дегегпипе йе яхе апд аЬипдапсе ог' а раг6си1аг арес!еа ог" КНА. )Зегайа ог гЬе йпе аггисгиге ог а раггки1аг ггапасйрг тау Ье аеееаеед Ъу 5! гпарршц ог НЬопис1еаье ргогес6оп (РгоГосо)а 10 апс1 1!). ТЬе иае о( еКЬег ог ГЬеье ГесЬпициеь айогча ГЬе десесГюп о( йе 5' апд 3' епде о( а раг6си1аг тКХА, ае ччей ае гЬе арйсе !ипсгюпя ргесиггюгя апс1 ргосезяпц !псегтед(- агеа о( тКХА. Рйтег ехгепяоп (Ргогосо1 12) ргочЫее а теаеиге о( йе апюипг ог" а раг6си1аг тКХА прес!еь апд айова ап ехасг де!ест)паг!оп ог" гЬе 5' епд ог" гЬе тКХА. ) !гогЕ й о)' пчо )с!идя )гггзг, айейпд г(ге рояйоп оу' тапег аг ог пеаг Йе еаггБ ~игуасе ге!айче1у го ойег зис)г таиег; зесоп4 геИпгц ойег реор!е го до ео. Т)ге)ггег и ипр!еаеапг апд 1И раЫ; йе еесопд й р(еазапг апд )г)цп!у раЫ. Вегггапд Киааей Рго1осо! 1 Рцппсайоп о1 КМА 1гогп Се!1ь апд Гьыеь оу АоЫ Рпепо! — Сиап~йп~игп ПЫосуапа1е — СЫого1оггп Ех1гасбюп т нг кеч то ялссг88гглг яляясАтю!н ог !!нтАст КНА 6ош се1Ь апд г(аялеа ь ареед.
СеПи!аг КХааеа аЬои1д Ъе !пасдчагед аа с)и)сИу аа роаа(Ые аг йе чегу 6гаг ага8е ш йе ехггасдоп ргосеяс Опсе йе епдо8епоиа КХааеа Ьаче Ьееп деяггоуед, йе ппшегПаге гЬгеас го йе лпге8пгу ог гЬе К!н)А ь Вгеас1у гедисед, апд риП6садоп сап ргосеед аг а пюге 8гасеги! расе. Весаые ог гЬе иг8епсу, шапу шегЬода (ог йе !ао!аг!оп ог шгасс КМА ггпу сеПа ые ягоп8 депагигапь яисЬ аа ВиашсПпгпш ЬудгосЫогЫе ог ВиапЫшшгп йюсуапаге го д(вгирг сеПя ао1- иЬП!ге йе(г согпропепгя апд депагиге епдоВепоиь КХааеь япш!гапеоиа1у (р1еаае аее гЬе !пгоггпадоп рапе1 оп СГЛАМ0!МГлМ БАЕт8).
ТЬе ые ог ВиапЫиишп (аогЬюсуапаге )п КМА ехггас6оп, 6гаг гпепдопед Ьпейу Ъу !Л16сЬ ег а1. (1977), нчаа досишепгес1 !п рарега риЫ(аЬед Ьу Нап ег а1. (1987) апд СЬ!гВлч!и ег а!. (!979). ТЬе Нап плегЬос1 ь 1аЪогюиа аа (г шчо1чеа ао1иЫПгагюп ог" ПЫА реПела !п рго8гея(че!у япаПег чо1ишеа ог 5 М ВиашсПпе ГЬгосуапале. 1п ГЬе СЬ)гВлч!и шегЬод, си!гигед сеПа ог гьлиеа аге Ьопю8епгаег1 ш 4 М длапЫ(п(иш ьогЬюсуапаге, апс1 гЬе !уааге ь 1ауегед опсо а депае сиаЬюп ог СаС1. Весаиае йе Ъиоуапг депягу ог КХА ш СаС! (1.8 Вйп1) ь пшсЬ Вгеагег йап гЬас ог" ойег сеПи!аг согпропепгя гКХАя апд шКХАа пи8гаге го йе Ьоггогп ог" гЬе шЪе дидпц и!ггасепсПйл8адоп (СПяп ег а1.
1974). Аа!оп8 аа гЬе атер ВгасПепь аге пог очег1оадед, ргоге(па геша)п ш йе ВиапЫшшш !увале нчЬПе ОНА Пиала оп йе СаС! силЬюп. Весаиае йе СЬ1г8лч(п плегЬос1 у)е1да К)н)А ог" чегу ЫВЬ г)иаПгу апг1 рипгу апд ь пог !аЬог-!плепяче, !Г Ъесаше йе алапдагд ГесЬп(с)ие диПп8 ГЬе еаг1у 1980а Гог ьо1алюп ог ипдерадей Ь18Ь-шо1еси!аг-нче!ВЬг КХА. Нончечег, йе плейод Ьаа опе нчеа)спеая !с ь ипянгаЫе Гог яши!гапеоы ргосеаяп8 ог" гпапу аашр1ея Рог гЬ!а ригроае, П Ьал Ъееп а1гпоаг согпр1еге!у д(я р!асед Ъу йе яп8)е-клер ГесЬшс)ие ог" СЬогпсгупаЫ апс1 ВассЫ (1987), ш лнЬ(сЬ ГЬе Виап(д(п)- шп гЬюсуапаге Ьогпо8епасе ь ехггасгед нч!гЬ рЬепоЬсЫогогогш аг гедисег1 рН.
Е1пп!пагюп ог' гЬе и1ггасепгг(6л8агюп ягер аПолчл шапу аашр1еа со Ье ргосеааед япийапеоы! у апд ареег61у ас пюделг соаг апд лн(гЬоиг аас66се !п у(е1д ог срла16у ог' КЫА. гог шапу шчеа68асогя гЬе яп81еагер гесЬп(г)ие деаспЪес1 ш Ргогосо! ! гегпаша гЬе шегЬод ог" сЬоке со 1ао1аге КЫА ггпу си1- гигед сеПл апд гпоаг апипа! 6ааиея ТЬеге аге гнчо с(гсишягапсея ш лчЬ)сЬ гЬе ып81е-егер ргоседиге Ь пог гесопипепдед. ага!, йе ргосесЬлге доеа пос ехггасг КХА ег6с)епг1у !гпмнп асПроае 6ашеа гЬаг аге псЬ 1п г681усеПг1ея КХА ь Ьеаг ргерагед 6ош гЬеае галлу апогеей Ьу а плог66садоп ог" йе шейод ог СЫг8нч(п ег а1.
(1979), деасПЪед Ьу Танап8аг ел а1. (1990). Яесопд, КХА ргерагед Ьу ВиашгПпе 1уа)а (а юше- 7.4 Рго(оса! 7: Ригз)зсатзоп оГ К)х(А)тот Се!Ь апсГ ТЬтиег 7.5 6гпеа сопсапппатед то а я8шВсаш ехтепт Ьу сеПи1аг ро1ухассЬаг(6еа апс( рготео81усапя ТЬеае соптапнпапса аге герогсе6 то ргечепт 901пЬ(1(гапоп оГ КХА аЕ(ег ргес(рЬабоп тч((Ь а1соЬ019, го шЬЕЬ11 гечегае-тгапаспргахе — ро1ушегахе сЬа(п геасбопа (КТ-РСК9), апс) со Ъзпс1 со шешЪгапех дцгш8 К)х(А Ыо(608 (Сгорре апс1 Мосье 1993; Ке ет а1. 1995; 5сЫс1с апс1 Егах 1995). 1Е сопгаш!па6оп Ьу рготео81усапа ап6 ро1уаассЬаг!6еа арреагх то Ъе а ргоЫегп, (пс106е ап ог8ап!с ехтгас6оп 51ер ап6 сЬап8е (Ье сопйбопа цае6 Со ргес!рпа(е зЬе К)х(А ах деаспЬе6 (п РгоСосо1 2.
ТЬе у!016 оГ гога1 КХА с)ерепсЬ оп сЬе г(мце ог се)1 юцгсе, Ъц( К иа Вепега11у ш ! Ье гап8е оЕ 4 — 7 )з8)ш8 оГ в(агбп8 Сивое ог 5 — 10 )з8) 10 се1Ьс ТЬе А, ГА та6о оЕ (Ье ехттасте6 КХА 19 8епега!)у 1.8 — 2.0. МАТЕВ!А! $ А ЕМРОКТАХТ Ргераге аП геа8епса цхЕЕ( !и ГЫ9 рГО1осо( зч!(Ь РЕРС-Ггеатес! Н О (р!еааЕ 9ЕЕ ГЬе Ыоггпа6оп рапе! оп НОз4З ТО (АЗ!Х ТНЕ ВАТТЕЕ МЕ!ТН КХА5Е).
СА()ТЕОХЕ Р1еаье аее Аррепс(!х 12 Еог арргорпа(е Ьапб!1пе оЕ гпа(епа!ь пзаг!сед чч(ГЬ <1>. СЫогоуогт:Ехоату! аЕсоЬо! (49Е7, ч)ч) <! > ЕЕЬапо! Ехоргорапо! ЕЕЕГизсГ и!Его8еп <! > РЬепо! <!> РЬохрЬасе-ЬиЕГегесГхайпе ГРВ5) Кез(шгес( !ог сеПх 5гозчп зп юхрепьюп апз( пюпо1ауегх оп1у. 5осВит асетате (2 м, рН 4.0) 5о)ипоп Р ГЕГепатиг)п8 50!от(оп) 4 м 5цап(с(!п(цш ЕЬюсуапасе с! > 25 шМ юйшп сцгате '2Н О 0.596 (зч)ч) юйшп !ацгу( хагсояпате О.! м 1)-шегсарзоезьапо! с! > РЬю(че 250 8 оГ 5цац!з((ц(шп змосуапазе 'ш 293 зп1 аГ Н,О, ! 7.6 гп! оЕ 0.75 м юйшп сззгазе (рН 7.0), апз( 26,4 гп1 оЕ (09о (зч)ч) юйшп 1ацгу! ьагсояпазе.
АсЫ а гпахпе6с Ьаг апс1 хз!г ЕЬе ю!шюп оп а сошЬзпазюп Ьеазег-х6ггег аз 65'С цп61 а!! !п5гейець аге ймо!чей 5зоге 5о!ц6оп Р аз гоозп зезпрегазше, апс! аз(с(036 ш! оГ 144 м яос!с !)пзегсаргоезЬапо( рег 50 пз! оЕ 5о1цзюп Р )цхг Ье(оге цхе. 5о!цзюп Р пзау Ье хзогез( !ог пюп(Ьх ас гоозп зегпрегазше ЪШ Ь зепя6че сц !Е5ЬЬ Хосе з Ьаз 5цап(з(!п(шп зч(1! ргесзр1(азе аз 1озч сешрегазцгех.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
