Диссертация (1335845), страница 20
Текст из файла (страница 20)
При этом различий в процентном содержаниинейронов ММЯ с локализацией ЭР в цитоплазме между контрольными ислучаями с БоАл установлено не было (F[1;22] = 2.918; p = 0.103). Прианализе сочетанного влияния БоАл и пола пациентов процент нейроновММЯ с ядерными ЭР (F[3;22] = 4.072; p = 0.023), но не сцитоплазматическими ЭР (F[3;22] = 1.158; p = 0.353), отличался между 4исследуемыми группами (мужчины и женщины контрольной и группы сБоАл).
Пропорция нейронов ММЯ с ядерными ЭР оказалась выше умужчин с БоАл по сравнению с мужчинами контрольной группы (F[2;16] =4.744; p = 0.028) и такая же тенденция только в меньшей степени отмечена уженщин (F[2;16] = 3.342; p = 0.065). У пациентов с БоАл пропорция нейроновММЯсядернымиЭРположительнокоррелироваласостадиейнейропатологических изменений по Braak (r = 0.726; p = 0.017).ЭРВ отличие от ЭР, ЭР локализовался главным образом в цитоплазменейронов ММЯ. Интенсивное иммуномечение ЭР было отмечено в нервныхволокнах и кровеносных сосудах (Рис.
49).Процентное содержание нейронов ММЯ с ядерными (F[1;22] = 0.954; p= 0.340) и цитоплазматическими (F[1;22] = 0.204; p = 0.657) ER междуконтрольными и случаями с БоАл не отличалось. Половые различия дляпропорции ММЯ нейронов с ЭР в контрольной и группе с БоАлотсутствовали. У женщин с БоАл процент нейронов ММЯ с ядерными ЭРположительно коррелировал с клинической степенью тяжести заболеванияпо шкале Рейсберга (r = 0.983; p = 0.003).142Рис. 49.
Эстрогеновые рецепторы (A-D) и (E-F) в ММЯ контрольных (A, C, E) ислучаев с БоАл (B, D, F). Экспрессия ядерных ЭР значительно выше у мужчины с БоАл(B), чем у мужчины контрольной группы (A) и, хоть и в меньшей степени, выше уженщины с БоАл (D) по сравнению с женщиной контрольной группы (C). Различий вокрашивании ЭР между контрольными случаями (E) и случаями с БоАл (F) необнаружено. Bar = 25мкм.143Соотношение размеров АГ и перикарионов нейронов с ЭР и ЭРПоложительная корреляция площади АГ с процентным содержаниемядерных ЭР установлена как в группе с БоАл (r = 0.707; p = 0.015), так и уконтрольных случаев (r = 0.718; p = 0.013).
При разделении по полу, этакорреляция обнаружена только у женщин (в контрольной группе r = 0.962; p= 0.002; в группе с БоАл r = 0.910; p = 0.012) и отсутствовала у мужчин.Таблица 28Процентное содержание нейронов с ЭР и в медиальном мамиллярномядре человекаКонтрольЧислоБоАл1111ядерные24.54.9 145.43.3 1цитоплазматические86.11.789.30.8ядерные1.40.51.90.3цитоплазматические86.72.188.32.9ЭР %:ЭР %:ЭР: эстрогеновый рецептор ; ЭР эстрогеновый рецептор ; 1 p = 0.002Сплайсинговые варианты мРНК ЭР в медиальном мамиллярном ядреЦПРВ настоящей работе полная последовательность кДНК классическоймРНК ЭР (GI:4503602) не могла быть амплифицирована при ЦПР и невыявлялась при электрофорезе на агарозном геле, возможноиз-занезначительного содержания мРНК высокого качества в посмертномматериале.
Поэтому она была исследована по частям, от первого дочетвёртого экзона (Рис. 50) и от четвёртого до восьмого экзона. Помимоэтого, определялся транскрипт от второго до пятого экзона для изученияналичия третьего и четвёртого экзона и два меньших фрагмента кДНК ЭРдля исключения наличия сплайсингового варианта э3 (с выпадениемтретьего экзона) и подтверждения наличия варианта э4 (отсутствие144четвёртого экзона): 1) от второго до четвёртого экзона и от третьего допятого экзона (Таблица 3).1(2) – 4Фрагмент кДНК ЭР (GI:4503602), состоящий из первых четырёхэкзонов, оказался наиболее сложным для ЦПР амплификации, чтопроявилось очень слабой окраской агарозного геля бромидом этидия (Рис.50).БыливыделеныследующиеЦПРпродуктысопределениемпоследовательности от двух случаев с БоАл #9 и #11 (#94-028 and #99-138):ампликон из 1000 нуклеотидов, содержащий экзоны 1, 2 and 3; транскриптиз ~ 800 азотистых оснований, содержащий экзоны 1, 2, 3, оказался новымсплайсинговым вариантом MB1, характеризующийся выпадением экзонногоинтрона U2 между нуклеотидами 573 и 741 (Рис.
51A); ампликон из ~ 600азотистых оснований содержал второй и третий экзоны; ампликон ~ 500нуклеотидов состоял из экзонов 1(2) (частично), 2, 3 и 4 (частично);транскрипт ~ 300 азотистых оснований представлен экзонами 1(2)(частично), 3 и 4 (частично) с выпадением второго экзона (сплайсинговыйвариант э2), при этом экзон 1(2) был соединён непосредственно с третьимэкзоном (Рис.
51B).MB1 - новый сплайсинговый вариант ЭРВ настоящей работе удалось впервые выделить из ММЯ случая с БоАл9 (#99138) транскрипт из 800 азотистых основанийс выпадением 168нуклеотидов в первом экзоне, комплементарых последовательности междунуклеотидами 573 и 741 мРНК ЭР человека (GI:4503602) (Рис. 52).Выпадающая последовательность первого экзона соответствует экзонномуинтрону типа U2 согласно номенклатуре Sharp и Burge (1997). Очевидно, чтоклассическая мРНК ЭР сохраняет этот интрон (Black, 2003).
Егосплайсинговый участок 3’ с “AG” и сплайсинговый сайт 5’ (“GT”) несоответствуют оптимальной консенсусной последовательности, что приводитк неэффективному сплайсингу. Этим можно объяснить, почему этот вариант145до сих пор не был обнаружен у человека и животных, несмотря насохранность сплайсинговых сайтов у мыши, крысы и шимпанзе (Рис. 53,Burset et al., 2000). Основываясь на работах с удалением различныхфрагментов домена A/B ЭР в фибробластах куриных эмбрионов идрожжевых моделях (Metzger et al., 1995), уместно предположить, чтообразующийсябелокбудетхарактеризоватьсяснижениемтрансактивационной функции 1 приблизительно в 4 раза.
Так как новыйвариант был выделен из мамиллярных тел и находится в первом экзоне ЭР,он получил название MB1 (mamillary body, exon 1). MB1 был такжеобнаружен в ММЯ двух контрольных случаев #2 и #4 (#02008, #00127)(Таблица 29, Рис. 50) и в таламусе пациента с БоАл #11 (#94028).Полученные результаты означают, что сплайсинговый вариант MB1 неявляется специфичным для БоАл и ММЯ, и может находиться в другихобластях мозга.Рис. 50. Примеры ампликонов (~1000, ~800, ~600, ~500 and ~300 нуклеотидов),полученных при ЦПР фрагмента кДНК ЭР между экзонами 1(2) и 4 (A). Ихреамплификация после выделения ДНК из агарозного геля показана в (B).
800bp – новыйсплайсинговый вариант MB1, 300bp – вариант с отсутствием второго экзона, AD –пациенты с болезнью Альцгеймера, C – контрольные случаи, m – мужчины, f – женщины,Mw – молекулярный вес маркера.146Рис. 51. A) новый сплайсинговый вариант MB1 (пациент с БоАл #9); B) изоформа Δ2мРНК ЭР (случай с БоАл #9); C) сплайсинговый вариант мРНК ЭР Δ4 (случай с БоАл#7); D) изоформа мРНК ЭР Δ (случай с БоАл #9). Стрелками указаны участки, где врезультате выпадения экзонов происходит сплайсинг мРНК ЭР.147361 atgaccatgaccctccacaccaaagcatctgggatggccctactgcatcagatccaaggg 4201 M T M T L H T K A S G M A L L H Q I Q G20421 aacgagctggagcccctgaaccgtccgcagctcaagatccccctggagcggcccctgggc 48021 N E L E P L N R P Q L K I P L E R P L G40481 gaggtgtacctggacagcagcaagcccgccgtgtacaactaccccgagggcgccgcctac 54041 E V Y L D S S K P A V Y N Y P E G A A Y60541 gagttcaacgccgcggccgccgccaacgcgcaggtctacggtcagaccggcctcccctac 60061 E F N A A A A A N A Q V Y G Q T G L P Y80601 ggccccgggtctgaggctgcggcgttcggctccaacggcctggggggtttccccccactc 66081 G P G S E A A A F G S N G L G G F P P L100661 aacagcgtgtctccgagcccgctgatgctactgcacccgccgccgcagctgtcgcctttc 720101 N S V S P S P L M L L H P P P Q L S P F120721 ctgcagccccacggccagcaggtgccctactacctggagaacgagcccagcggctacacg 780121 L Q P H G Q Q V P Y Y L E N E P S G Y T140781 gtgcgcgaggccggcccgccggcattctacaggccaaattcagataatcgacgccagggt 840141 V R E A G P P A F Y R P N S D N R R Q G160Рис.
52. Последовательность экзонного интрона, которая пропущена в новомсплайсинговом варианте ЭР MB1, отмечена жирным шрифтом (GenBank AY750962).человекшимпанземышькрысаконсенсус GT-AGРис. 53.5'интрон3'ag|gtctac...cccacggccagcag|gag|gtctac...cccacggccagcag|gcg|gtctac...cgcacggccagcag|gcg|gtctat...cgcatggccaccag|gag|gtragt...yyttyyyyyyncag|g148С помощью поликлональных антител, специфично распознающихсплайсинговыйсайтМВ1,иммуноцитохимическаяэкспрессияэтоговарианта, свидетельствующая о его наличии на уровне белка, былаобнаружена в различных отделах головного мозга человека.Иммуноцитохимическая экспрессия MB1 выявлена в нейронах,волокнистых и протоплазматических астроцитах и эндотелиальных клеткахкровеносных капилляров и сосудов (Рис.
54). В нейронах наблюдалсягранулярный(пунктатный)илигомогенныйтипокрашивания,полокализации соответствующий расположению эндоплазматической сети.Интенсивность окраски астроцитов оказалась значительно выше, чемнейронов. При окрашивании соседних срезов различных структур мозгаантителами, распознающими МВ1 и классический ЭР, было выявлено, чтовариант МВ1 локализуется, как правило, в тех же группах нейронов иглиальных клеток, что и классический ЭР, но в меньшем количестве. МВ1обнаружен преимущественно в цитоплазме нейронов, тогда как классическийЭР - в их ядрах (Рис. 55). Следует отметить, что наличие классического ЭРне означает обязательного присутствия МВ1.
Так, в зернистом слое корымозжечка выявлено значительное количество нейронов с ЭР. Однако, МВ1в этих клетках обнаружен не был.В различных отделах коры больших полушарий окрашивание МВ1встречалось редко, главным образом в пирамидных нейронах ганглионарногослоя.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
