Диссертация (1335845), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Нейроны с различной интенсивностью окрашивания отмечены впередне-медиальном,передне-вентральном,паравентрикулярном,медиальном дорсальном ядрах таламуса. Довольно часто встречалисьскопления астроцитов, интенсивно окрашенных на МВ1. В мозжечке МВ1выявлен в ядрах белого вещества, в основном в зубчатом ядре. В нейронахголубоватогопятнаичёрнойсубстанцииобнаруженывключениялипофусцина.
МВ1 в этих структурах мозга отсутствовал. В хвостатом ядре,бледном шаре и покрышке МВ1 наблюдался в астроцитах и единичных149нейронах. Значительное количество нейронов с МВ1 обнаружено в ядрахмоста, дорсальном двигательном ядре блуждающего нерва в продолговатоммозге,двигательныхядрахпереднихроговспинногомозгаитуберомамиллярном ядре гипоталамуса. В связи с этим последующаяколичественная оценка изменений интенсивности окрашивания МВ1 вразличных возрастных группах и при БоАл осуществлялась именно вгистаминэргическом ТМЯ. В качестве параметра, отражающего уровеньэкспрессии МВ1 на уровне белка, использовалось определение удельнойдоли профильной площади нейронов ТМЯ, занятой иммунореактивным МВ1.Средний процент профильной площади нейронов ТМЯ, занятой МВ1,увеличивался с возрастом у женщин (r = 0.640; p = 0.002) и не изменялся пристарении у мужчин (r = -0.133; p = 0.556).
После разделения группы женщинс учётом среднестатистического возраста наступления менопаузы оказалось,что иммуноцитохимическая экспрессия МВ1 выше у женщин послеменопаузы (10 случаев в возрасте 58-94 лет), чем у молодых женщин (7случаев в возрасте 21-46 лет) (p = 0.008). Увеличение содержания МВ1 былоотмечено у женщин в период перименопаузы (3 случая в возрасте 49-50 лет)(Рис.
56, 57). Однако статистически достоверных различий между группамимолодых женщин и женщин в период менопаузы не выявлено (p = 0.087). Умолодых мужчин (10 случаев в возрасте 21-46 лет) процент профильнойплощади нейронов ТМЯ, занятой МВ1, был значительно выше, чем умолодых женщин (p = 0.032). Достоверных различий между группамимолодых мужчин и мужчин в возрасте 56-85 лет (12 случаев) не установлено.При болезни Альцгеймера (18 случаев в возрасте 54-85 лет) выраженныхизменений иммуноцитохимической экспрессии МВ1 в ТМЯ не выявлено. Нидлительность промежутка между моментом смерти и взятием материала(p>0.573), ни длительность фиксации (p>0.231) не влияли на результатыэтого исследования.150Рис.54.ИммуноцитохимическоеокрашиваниеМВ1вастроцитахрядомстуберомамиллярным ядром (A), в астроцитах передней комиссуры (B), в эндотелиальныхклетках капилляров (C) и нейронах туберомамиллярного ядра (D).
Объектив x63.Рис. 55. MB1 и классический ЭРα ко-локализуются в одних и тех же нейронахдорсального двигательного ядра блуждающего нерва у мужчины 73 лет с болезньюАльцгеймера.Соседниесрезыокрашеныантителами,распознающимиМВ1иклассический ЭР. Стрелками указаны нейроны с высоким уровнем содержания обоихвариантов. Увеличение объектива x40.151Рис.56.ИммуноцитохимическаяэкспрессияMB1втуберомамиллярномядрегипоталамуса выше у молодого мужчины 20 лет (A) и женщины 65 лет (D) по сравнению смолодой женщиной 28 лет (B).
Увеличение содержания белка MB1 заметно уже в периодперименопаузы у женщины 49 лет (C). Увеличение объектива x40.152Рис. 57. График, демонстрирующий средние значения % профильной площади нейроновтуберомамиллярного ядра, занятой иммунореактивным веществом МВ1. Ж21-46 – группа7 женщин в возрасте 21-46 лет, Ж49-50 – 3 женщины в возрасте 49-50 лет, Ж58-94 –группа 10 женщин 58-94 лет, M20-49 – 10 мужчин в возрасте 20-49 лет, M56-85 – группа12 мужчин в возрасте от 56 до 85 лет.
Содержание МВ1 в нейронах туберомамиллярногоядра достоверно выше в группе молодых мужчин по сравнению с молодыми женщинамии в значительной степени увеличивается у женщин после менопаузы.153Рис. 58. Единственный ампликон ~350bp (прямой праймер во втором экзоне, обратныйпраймер в четвёртом экзоне) содержит 2,3 и 4 экзоны у 5 пациентов с БоАл (ряды 3-7) и 5контрольных случаев (ряды 8-12) исключает наличие сплайсингового варианта сотсутствием третьего экзона. Ряд 1 – маркер молекулярного веса. Сокращения в рис. 28.Рис.
59. Транскрипты ~580bp (прямой праймер в третьем экзоне, обратный праймер впятом экзоне) у пациентов с БоАл (ряды 2-6) и контрольных случаев (ряды 7-11) являютсяфрагментами классической мРНК ЭР, содержащими 3, 4 и 5 экзоны. Ампликоны ~220bpлишены 4-го экзона (сплайсинговый вариант Δ4). Дополнительные полоски у случаев,обозначенных 83f, 62m и 61f, оказались неидентичными кДНК ЭР. Ряд 1 –молекулярный маркер. Сокращения в рис.
28.154Рис. 60. Транскрипты ~780bp (прямой праймер во втором экзоне, обратный праймер впятом экзоне) содержат 2, 3, 4 и 5 экзоны гена ER у пациентов с БоАл (полоски 2-6) и уконтрольных случаев (ряды 7-11), тогда как полоса ~400bp представляет сплайсинговыйвариант мРНК ER, лишённый четвёртого экзона. Полоса 1 – молекулярный маркер. Ntc –отрицательный контроль со стерильной водой.
Сокращения в Рис.28.Рис. 61. ~800bp и ~600bp указывают на фрагменты с наличием и отсутствием экзона 7.Полоса 1 – маркер молекулярного веса. Продукты ЦПР получены с прямым праймером вчетвёртом экзоне и обратным праймером в восьмом экзоне от 5 случаев с БоАл,показанных в полосках 3-7 и от 5 контрольных случаев в рядах 8-12.
Отрицательныйконтроль (стерильная вода) находится в последнем ряду, wt – классическая мРНК ER.Другие сокращения перечислены в Рис.28.155Таблица 29Перечень транскриптов ЦПР, визуализируемых после электрофореза на агарозномгеле у контрольных и случаев с БоАл№ПолВозраст1(2) – 44-82-42-53-5Контрольные случаи1)ж611000800,600350780,400580,400,220,2)м621000,800,600,500800,600350780,400580,400,2203)м71н.о.800,600350н.о.4)ж761000,800,500800,600350780,400580,400,2205)ж831000,600,500,300800,600350780580,400,220580Случаи с болезнью Альцгеймера6)ж611000,600,500,300800,600350н.о.7)м651000,600,500800,600350780,600,400 580,400,2208)м731000,600,500800,600350780,400580,2209)ж761000,800,600,500,300 800,600350780,400580,22010)ж841000,500800,600350780,400580,22011)м701000,600,500,300800,600350н.о.н.о.580Фрагменты кДНК ЭР между экзонами 1(2) и 4 (1(2)-4), экзонами 4 и 8 (4-8),экзонами 2 и 4 (2-4), экзонами 2 и 5 (2-5), экзонами 3 и 5 (3-5); 800 азотистыхоснований – новый вариант MB1 с выпадением 168 нуклеотидов в первомэкзоне, соответствующих интрону типа U2; 300 азотистых оснований –вариант э2; 600 нуклеотидов – вариант э7; 400 нуклеотидов и 220нуклеотидов – вариант э4; ж – женщина, м – мужчина, н.о.
– не обнаружен.Все продукты, визуализируемые на фотографиях, были изолированы,очищеныире-амплифицированысопределениемнуклеотиднойпоследовательности.2-4При амплификации транскриптов, содержащих второй, третий ичетвёртый экзоны,во всех случаях выявлен продукт из порядка 350азотистых оснований (Таблица 29, Рис.
58). Окрашивание бромидом этидиябыло интенсивнее в группе с БоАл по сравнению с контрольными случаями.Отсутствие других фрагментов в агарозном геле исключает наличие156сплайсингового варианта с выпадением третьего экзона (э3) в ММЯизученных случаев.3-5ЦПР фрагмента кДНК ЭР между третьим и пятым экзонамипозволила обнаружить два основных продукта: 1) транскрипты ~ 580нуклеотидов, содержащие третий, четвёртый и пятый экзоны и 2) ампликоны~ 220 азотистых оснований с большей частью третьего и пятого экзонов (каки следовало ожидать от дизайна праймеров) и полным отсутствиемчетвёртого экзона (сплайсинговый вариант э4) (Таблица 29, Рис. 59).2-5Результатом амплификации участка кДНК ЭР между вторым и пятымэкзонами стало выявление транскриптов: 1) из ~ 780 нуклеотидов,содержащих экзоны 2, 3, 4 и 5 гена ЭР и 2) из ~ 400 азотистых оснований,являющегося изоформой мРНК ЭР, лишённой четвёртого экзона (Рис.
50,51C). Помимо этого, у мужчины 65 лет с БоАл обнаружен ампликон из ~ 600азотистых оснований, содержащий экзоны от второго до пятого свыпадением 57 нуклеотидов в четвёртом экзоне (Таблица 29, Рис. 60).4-8ЦПР фрагмента от четвёртого до восьмого экзона позволилообнаружить два основных продукта: 1) из ~ 800 азотистых оснований, всостав которого входят экзоны 4 (частично), 5-ый, 6-ой, 7-ой, 8-ой полностьюи 2) из ~ 600 нуклеотидов, в состав которого включены экзоны 4, 5, 6 и 8, аседьмого экзона нет (вариант э7) (Рис. 51D).
Примечательно, что экспрессияизоформы э7 ЭР (~ 600 нуклеотидов) была достаточно высокой у всехслучаев по сравнению с MB1, э2 и э4 (Таблица 29, Рис. 61).По результатам ЦПР ни в одном из изученных случаев не установленоналичия изоформ э3, э5 и э6. Однако, полностью исключитьвозможность минимального уровня экспрессии сплайсинговых вариантовЭР, отличных от обнаруженных в настоящем исследовании, нельзя.157Количественная ЦПРВеличина изменений, связанных с БоАл, определялась попарно сконтрольными случаями: 1 и 6, 2 и 7, 3 и 8, 4 и 9, 5 и 10, а такжеотносительно каждого из упомянутых референтных генов.
Уровеньэкспрессии классической мРНК ЭРα, оцениваемой транскриптами на границеэкзонов: 1) 6 и 7, 2) 7 и 8, 3) 2 и 3 (т.е., кодирующих интактные домены длясвязывания с лигандами и ДНК), был в 2-3 раза выше при БоАл посравнению с контрольными случаями (p = 0.05). Примечательно, что приБоАл у женщин отмечено более низкое содержание классической мРНК ЭРα,чем у мужчин (p = 0.058), что подтверждает более значительное повышениеиммунореактивности ядерных ЭРα, описанное ранее в ММЯ мужчин с БоАл(Ishunina et al., 2003).
Судя по результатам ЦПР и порядку циклаколичественной ЦПР, содержание изоформы э2 значительно ниже, чем э7и э4 (Таблица 30, Рис. 50, Рис. 58-61).Статистически достоверных различий в экспрессии сплайсинговыхвариантов э7 и э2 между пациентами с БоАл и контрольными случаямиобнаружено не было (Таблица 30). Однако, пропорциональное соотношениеизоформы э7 к классической мРНК ЭРα (транскрипты 6-7 и 7-8) оказалосьсниженным при БоАл (p = 0.037), тогда как соотношение э2 к ампликонам2-3 и 1(2)-2 не изменялось (p = 0.841). Более того, уровень транскрипцииклассической мРНК ЭРα и изоформы э7 уменьшался с возрастом как приБоАл (r = -1.000; p = 0.0001), так и у контрольных случаев (r = -0.900; p =0.037 для ампликона между экзонами 2 и 3; r = -1.000; p = 0.0001 для э7 итранскрипта между экзонами 7 и 8).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
