Диссертация (1174378), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Пациенты с БА средней степени тяжести получали терапию,соответствующую 3 ступени лечения, которая включала комбинацию из ИГКС ибронходилятотора пролонгированного действия. Дети с тяжелой степенью БАпомимоингаляционныхпрепаратовполучаютантиIgEтерапию,чтосоответствует 5 ступени протокола лечения больных с БА. Важно отметить, что вдень забора биологического материала пациенты не получали базисную терапии.2.2 Общая схема исследованияДля исследования врожденного иммунитета на системном и локальномуровне у пациентов с БА и здоровых детей был разработан комплексный подход.Общая схема исследования представлена на рисунке 5.45 Соскобы со слизистой полостиноса и носоглоткиОпределениеэкспрессии геновTLR2, TLR4, TLR9,HBD1, IL-28BВыделениеРНКПолучениелейкомассыПериферическаякровьПЦР-РВОпределение экспрессии рецепторов TLR2,TLR4 Проточная цитометрияОпределение цитокинов IL-28B, IL-4,IL-33, TGFB, TSLP ИФА (eBioscience,USA)СывороткакровиIL-1, IL-1ra, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-αиммунофлюоресцентный анализНазальныесмывы(Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader, USA )Рисунок 5.
Схема исследования показателей врожденного иммунитета удетей с бронхиальной астмойУ пациентов был получен соскоб со слизистой полости носа и носоглотки, атакжелейкомасса.ИзбиологическогоматериалаполучаликДНКдляпоследующего определения уровня экспрессии генов TLR2, TLR4, TLR9, HBD-1,и IL-28В методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени(ПЦР-РВ).Параллельно на лейкоцитах периферической крови оценивали экспрессиюрецепторов TLR2 и TLR4 методом проточной цитометрии.На втором этапе исследования для определения содержание цитокинов всмывахизполостииммуноферментногоносаи всывороткеиспользовалиметодыи иммунофлюоресцентного анализов (ELISA Kit for46 крови Interleukin 28B фирмы Cloud-Clone Corp., USA; Bio-Plex MAGPIX MultiplexReader, USA).Далее представлено подробное описание методов.2.3 Получение биологического материалаВ качестве биологического материала в работе были использованы соскобыслизистой оболочки полости носа и носоглотки, смывы из полости носа, а такжецельная кровь, собранная в пробирку с ЭДТА, сыворотка и лейкомасса.Соскоб со слизистой полости носа и носоглотки получали с помощью«цитощёточки» типа D [6].
Методика взятие материала была идентична, ноотличалась глубиной проникновения и инвазивностью. После взятия материалацитощеточку помещали в стерильную пробирку с лизирующим буфером. В ходеисследования у первых 20 детей материал забирали из двух точек, включаяслизистую полости носа и носоглотки. При анализе полученных данных, былообнаружено, что показатели экспрессия генов TLRs оказались сопоставимы всоскобах из носоглотки и полости носа. В связи с чем было принято решение впользу менее травматичного и неинвазивного метода.
В дальнейшем в качествебиологического материала для исследования использовали соскобы со слизистойоболочки полости носа. Это оправдано меньшей инвазивностью, но достаточнойинформативностью метода [6]. Эпителий верхних и нижних дыхательных путейимеют общие маркеры активации [159]. Показано патогенетическое единствоверхнегоинижнегоотделовреспираторноготракта,особенноприаллергопатологии, что отражается в концепции ВОЗ «одни дыхательные пути –одно заболевание» [40, 159].Заборвенознойкровипроизводилсястандартнымметодомвотделении стационарозамещающих технологий ФГАУ «НМИЦ здоровья детей»Минздрава России. Кровь забиралась одновременно с плановым исследованиемгруппы анализов пациентов. Из полученного материала выделяли лейкоцитарную47 массу, строго следуя протоколу, а также сыворотку крови для проведенияиммуноферментного анализа (ИФА).2.3.1 Получение лейкоцитов периферической кровиДля получения лейкомассы у детей получали 3 мл венозной крови впробирку с антикоагулянтом ЭДТА.Для осаждения эритроцитов использовали стерильный 6% раствор декстранаиз расчета: 1 часть декстрана (1 мл) и 5 частей периферической крови (5 мл).После этого пробирки с кровью и декстраном помещали в термостат под углом45° и инкубировали 30 минут при температуре 37°С.Послеинкубациинадосадочнуюжидкость,содержащуюлейкоциты,собирали в отдельные пробирки и отмывали от декстрана в Среде 199 с солямиХенкса.
Для этого к 3 мл лейкомассы добавляли 1 мл питательной среды иресуспендировали в ней клетки, после чего центрифугировали 15 минут при 200g(1500 об/мин) в центрифуге HighSpeedMiniCentrifuge (Германия). Надосадочнуюжидкость удаляли, а к осажденным клеткам снова добавляли 1 мл среды,ресуспендировали в ней клетки, центрифугировали 15 минут при 200g вцентрифуге.
Данную процедуру повторяли 2 раза. После последней отмывки кклеткам добавляли 1 мл среды 199) Хранили при -70°С [13].На втором этапе исследования для получения назального смыва в носовойход вводили по 1 мл теплого стерильного изотонического раствора натрияхлорида. Промывную жидкость собирали в стерильный эппендорф.48 2.4 Определение уровня экспрессии генов TLR2, TLR4, TLR9, HBD1,IL-28B методом ПЦР в режиме реального времени2.4.1 Выделение РНК из соскобов со слизистой оболочки полости носа илейкоцитов периферической кровиИз соскобов со слизистой полости носа и лейкоцитов крови выделяли общуюРНК методом аффинной сорбции на частицах силикогеля, используя набор длявыделения РНК «АмплиПРАЙМ Рибо-сорб» (ИнтерЛабСервис, РФ) строго всоответствии с протоколом.Протокол выделения РНК: лизирующий раствор прогреть до полногорастворения кристаллов при 65°С на термостате «Термит» («ДНК-технология»,РФ) и внести в промаркированные пробирки по 450 мкл лизирующего буфера и100 мкл образца.
Содержимое пробирки перемешать на мини-центрифугеМикроспин FV-2400 (Латвия), процентрифугировать 5 сек при 5000 об/мин намикроцентрифугеHighSpeedMiniCentrifuge(Германия).По25мклресуспензированного сорбента добавить в каждую пробирку, перемешать иосадить на микроцентрифуге в течение 30 сек при 10 тыс.об/мин. После этогонадосадочную жидкость удалить.В пробирки добавить по 400 мкл раствора для отмывки 1, перемешать дополного растворения сорбента, процентрифугировать при 10 тыс.об/мин 30 сек иудалить надосадочную жидкость.
Добавить в пробирки по 500 мкл раствора дляотмывки3,перемешатьдополногоресуспензированиясорбента,процетрифугировать при 10 тыс. об/мин 30 сек и удалить надосадочнуюжидкость. Данную отмывку производить дважды.По 400 мкл раствора 4 добавить в пробирки, перемешать до полногорастворения сорбента, процентрифугировать при 10 тыс. об/мин 30 сек и удалитьнадосадочную жидкость. Далее осадившийся в пробирках сорбент подсушить втермостате при 60°С 15 минут, крышки пробирок должны быть открыты.Добавить в пробирки по 50 мкл РНК-буфера, перемешать и поместить в термостат49 на 2-3 мин при 60°С. Перемешать и процентрифугировать пробирки намаксимальных оборотах в течение 1 мин.Полученная надосадочная жидкость содержит очищенную РНК клеток,которую необходимо аккуратно отобрать из пробирок, не захватывая сорбент, ихранить при температуре минус 70°С.Концентрацию полученной РНК и ее чистоту оценивали с помощьюмикроспектрофотометра NanoDrop 2000, позволяющий проводить быструюпроверку концентраций и качества образцов нуклеиновых кислот.
Для этогомикропипеткой вносили 2 мкл очищенной РНК на неподвижный модуль(пьедестал), сверху на каплю опускали подвижный модуль прибора, в результатечего из образца формируется столбик жидкости между подвижным инеподвижным модулями. Высота столбика регулируется автоматически вдиапазоне 0,05-1,00 мм.Прибор измеряет поглощение света в столбике образца.
С помощьюпрограммы Nucleic Acid при длине волны 260 нм определяли концентрацию РНКв исследуемом образце. В качестве чистого контроля (Blank) использовали ddH2O.Для количественного определения содержания РНК в приборе используетсяуравнение Ламберта-Бера, видоизмененное за счет использования факторапересчета единиц в нг, умноженные на см и делённые на мкл. Уравнение имеетследующий вид:c = (A * ɛ) / b, где c – концентрация нуклеиновой кислоты (нг/мкл); A –поглощение в единицах оптической плотности; ɛ - зависимый от длины волныкоэффициент экстинкции, нг*см/мкл (для РНК = 40 нг*см/мкл); b – длинаоптического пути, см.По величине соотношения 260/280 оценивали степень чистоты РНК, котороесоставляет ~ 2,0 для «чистой» РНК.
Дополнительным критерием «чистоты» РНКявляется соотношение 260/230 и его величина находится в интервале 1,8-2,2. Есливеличина вышеуказанных соотношений находится ниже данных значений, то этоможет свидетельствовать о наличии загрязнителей.50 Далее на полученных образцах РНК проводилась реакция обратнойтранскрипции (ОТ) для получения кДНК с использованием фермента ревертазы, аследующим этапом проводится ПЦР амплификация для определения уровняэкспрессии генов TLR2, TLR4, TLR9, HBD1 и IL-28B.2.4.2 Реакция обратной транскрипции (ОТ)Реакцию ОТ проводили для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) наматрице мРНК генов TLR2, TLR4, TLR9, HBD1 и IL-28B с использованиемнабора реагентов для проведения реакции обратной траскрипции фирмы«Синтол» строго по инструкции фирмы-производителя. В пластиковой пробирке(Axygen, США) готовили смесь №1 праймеров на количество исследуемых проб:1 мкл OlygodT-праймера (набор олигонуклеотидов разной длины, в составкоторых входит только тимин), 15 ОЕ/мл, 1 мкл Random 6–праймера (случайныепраймеры длиной шесть нуклеотидов), 15 ОЕ/мл и 3 мкл деионизованной воды на1 пробу (Таблица 3).
В пронумерованные пробирки вносили по 10 мклвыделенной РНК и добавляли по 5 мкл смеси праймеров. Для качественнойпостановки системы помимо пробирок с клиническими образцами использовалиотрицательныйконтроль,вкоторыйвместоРНКдобавляли10мклдеионизированной воды. Полученную смесь перемешивали на вортексе иинкубировали в термостате 5 минут при температуре 75оС и охлаждали в течение5 минут при 4оС. В отдельной пластиковой пробирке (Axygen, США) готовилисмесь №2, содержащую в расчете на 1 исследуемый образец: 12 мкл 2,5 xреакционнойсмеси,1 мкл ревертазы(MMLV-RT),50 ед/мкл, 2 мклдеионизированной воды (Таблица 4). В каждую пробирку с исследуемой пробойдобавляли по 15 мкл приготовленной смеси и инкубировать пробирки в CO2инкубаторе при температуре 37оС 40 минут.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
