Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1174378), страница 10

Файл №1174378 Диссертация (Особенности врожденного иммунитета у детей с бронхиальной астмой) 10 страницаДиссертация (1174378) страница 102020-05-24СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 10)

Для инактивации фермента M-MuLVReverseTranscriptaseСинтезированнаянагретькДНКпробиркиможет92оСиспользоваться51 довтечении5непосредственноминут.для амплификации методом ПЦР или храниться при -20оС или -70оС болеепродолжительное время.Таблица 3. Объемы реактивов для приготовления реакционной смеси припроведении реакции обратной транскрипцииПриготовление смеси №1РеагентОбъем, мклПраймер Random-6, 15 ОЕ/мл1Праймер Oligo(dT)15, 15 ОЕ/мл1ddH2O3Общий объем смеси на 1 пробу5Приготовление смеси №2РеагентMMLV-RT, 50 ед/мкл12,5Х Реакционная смесь10ddH2O4Общий объем смеси на 1 пробу152.4.3 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времениПЦР в реальном времени (или количественная ПЦР, англ.

Real-time PCR) метод, используемый для одновременной амплификации и измерения количестваДНК. Преимуществом данного подхода является возможность совмещениядетекции и количественного определения специфической последовательностиДНК в образце в реальном времени после каждого цикла амплификации [43].52 ПЦР проводили с использованием «Набора для проведения ПЦР РВ»(«Синтол», Россия). В стерильных пробирках 1,5 мл, типа Эппендорф, готовилиПЦР-смесь, состоящую из 2 мкл dNTp 2,5 mM, 2 мкл 10xПЦР буфера, 2мкл MgCl225 mM, 1 мкл Forward primer 10 пкмоль/мкл, 0,1 мкл Reverse primer 10пкмоль/мкл, 0,3 мкл Taq ДНК-полимеразы 5Е/мкл и 3,7 мкл деионизированнойводы в расчете на 1 образец (Таблица 4).Таблица 4.

Объемы реактивов для приготовления реакционной смеси дляпроведения ПЦР-РВПриготовление смеси для ПЦР-РВОбъем, мклПрямой праймер (TLR2/TLR4/TLR9/HBD1/IL-28B/Actin),110 пкмоль/мклОбратный праймер (TLR2/TLR4/TLR9/HBD1/IL-28B/Actin),110 пкмоль/мклTaq ДНК-полимераза, 5Е/мкл0,3dNTP, 2,5 мМ2,510 х буфер SYBR Green I2,5MgCl2, 25 мМ2,5dd H2O2,5Общий объем смеси на 1 пробу12Далее в пронумерованные пробирки (200 мкл, Axygen, США) вносили по 3мкл кДНК, полученной в результате ОТ, и добавляли 12 мкл приготовленнойПЦР-смеси. Для качественной постановки помимо пробирок с клиническимиобразцами ставили отрицательный контроль, в который вместо ДНК добавляли 3мклдеионизированнойводы.Образцы53 помещаливАмплификатор детектирующий ДТ-96 («НПО ДНК-Технология», РФ) и запускали программуамплификации, которая представлена в Таблице 5.Таблица 5.

Программа амплификации для определения уровня экспрессиигенов TLR2, TLR4, TLR9№блокаТемпература,МинСекоКоличествоцикловС19510012940154062030900153100В результате реакции получали зависимости интенсивности флуоресценцииот количества циклов амплификации (рисунок 6).Рисунок 6. Зависимость интенсивности флуоресценции интеркалирующегокрасителя SYBR Green I в зависимости от времени амплификации гена TLR254 Для определения экспрессии исследуемого гена также анализировалипоказатели контрольного (референсного) гена, или гена сравнения. В качествереференсного гена был выбран "ген домашнего хозяйства"- ген актина, уровеньэкспрессии которого считается относительно постоянным в различных тканях[135].ДляопределенияспецифичностиПЦР-продукта,послереакцииамплификации проводили процедуры плавления, график которой представлен нарисунке 8.

В режиме плавления происходит повышение температуры в заданныхграницах с определенным шагом (с выдержкой времени после каждого шага) иизмерение интенсивности флуоресценции при каждой температуре. Приувеличении температуры ДНК денатурирует, в результате чего краситель SYBRGreen I переходит в раствор и перестает флуоресцировать. При достижениитемпературы плавления специфического ПЦР-продукта происходит резкоепадение интенсивности флуоресценции, так как сразу денатурирует большоеколичество ДНК и SYBR Green I массивно выходит в раствор. На графикепроизводной изменения интенсивности флуоресценции это выражается в видепика (рисунок 7).55 Рисунок 7.

Кривая плавления для определения специфичности продуктовамплификации.По оси абсцисс – номер цикла, по оси ординат – уровень флуоресценции.Продукты амплификации плавятся при температуре 82С, отрицательныеконтроли – изолиния, что свидетельствует об отсутствии в них ДНК.Определение количества копий исследуемых генов производился покалибровочным прямым, ранее разработанным на кафедре иммунологии МБФ длягенов TLR2, TLR4, TLR9, HBD1 и IL-28B.

Стандартизация результатов ПЦР-РВ,полученныхвпроцессеисследования,проводилиотносительноуровняэкспрессии гена β-актина.Длякаждогообразцаполучализначениелогарифмачислакопийисследуемого гена (TLR2, TLR4, TLR9, HBD1 и IL-28B) и числа копий гена βактина для нормировки результатов. Количество копий определяемого гена вдальнейшем пересчитывалось относительно 1 млн копий гена β-актина для геновTLR2, TLR4, TLR9, IL-28B и относительно 1 000 копий гена β-актина – для генаHBD1.Число копий исследуемого гена рассчитывалось по формуле (на примерегена IL-28B):56 N=10log (IL-28B) – (log (β-актин)-3), где N – число копий гена. Данная формулаприменима для определения количества копий генов TLR2, TLR4, TLR9, HBD1 иIL-28B.Параллельно с этим анализ результатов проводили относительнымметодом измерений по DDCt, получая результаты в виде относительных единицRQ (relative quantity), показывающих во сколько раз больше или меньшеэкспрессия гена-мишени в исследуемом образце по отношению к референсномуобразцу [20].

В качественно гена эндогенного контроля был использован ген βактина.Для использования этого метода необходимы следующие условия:1. Эффективности реакций амплификации исследуемых генов и генаэндогенного контроля (ген «домашнего хозяйства») должны бытьодинаковыми (могут отличаться не больше, чем на 5%) и составлять95±5%.2.

Необходимо чтобы экспрессия гена эндогенного контроля не отличаласьбольше, чем на 5-7 циклов (или Ct) от исследуемого гена или былаодинаковой с ним (чтобы экспрессия была сравнима).3. Необходимо так подобрать концентрацию исследуемых образцов чтобыони давали сигнал (Ct - порог насыщения реакции (cycle threshold),определяется как точка пересечения графика накопления ДНК и пороговойлинии) на 20-25 цикле.4. Необходимо проводить нормировку по концентрации РНК, используемойв эксперименте.2.5 Оценка экспрессии TLR2, TLR4 на лейкоцитах периферическойкрови методом проточной цитометрииИзучение экспрессии TLR2 и TLR4 на лейкоцитах периферической кровиоценивали проводили методом проточной цитофлуорометрии.

Работу проводилисовместно с ассистентом кафедры иммунологии Огурцовой А.Д. Для этого 10057 мклцельнойкровиинкубироваливтечение10минутсмеченымимоноклональными антителами. Затем осуществляли лизис эритроцитов. Для этогов каждую пробирку добавляли 900 мкл лизирующего раствора IOTest 3LysingSolution (BeckmanCoulter, США). После чего образцы инкубировали втермостате при температуре 37°С в течение 9 мин.

Далее клетки дваждыотмывали при 1000 об/мин в растворе Хенкса. Анализ образцов проводили напроточном цитофлуориметре Beckman Coulter Navios (BeckmanCoulter, США). Вкаждом образце было проанализировано не менее 100000 событий. Дляидентификации клеток использовали следующие моноклональные антитела:CD14, меченые APC («e-Biosciences»), CD45, меченые ECD («e-Biosciences»),СD282 (TLR2) и CD 284 (TLR4), меченые Alexa Fluor 488 («e-Biosciences»),изотипический контроль Mouse IgG2a, меченые Alexa Fluor 488 («e-Biosciences»).Анализ образцов проводили на проточном цитометре «Navios» (Beckman coulter,Inc.).ДлякаждогообразцабылопределенпроцентСD14+-моноцитов,лимфоцитов и гранулоцитов, несущих TLR2 или TLR4, а также среднююинтенсивность экспрессии (СИФ) этих рецепторов на клетках периферическойкровиубольныхБАиздоровыхдоноров.Среднююинтенсивностьфлуоресценции рассчитывали, как отношение интенсивности флуоресценцииобразца к интенсивности флуоресценции изотипического контроля:СИФ=СИФ образца / СИФ изотипического контроля58 Рисунок 8.

Средняя интенсивность экспрессии TLR2 на CD14+ моноцитах(слева) и TLR4 на гранулоцитах (справа)2.6 Определение цитокинов (IL-28B, IL-33, IL-4, TSLP) методомиммуноферментного анализаВ качестве материала исследования были использованы смывы со слизистойоболочки полости носа и сыворотка крови пациентов с БА и здоровых детей.Перед исследованием все пробы доводили до комнатной температуры (18-25°С),аккуратноперемешивалиипроводилиоценкусодержаниябелканамикроспектрофотометре NanoDrop™ 2000. В качестве контрольного раствораиспользовали ddH2O. На пьедестал микроспектрофотометра микропипеткойвносили 1 мкл назального смыва или сыворотки крови и с помощью программыProtein A280 получали изображения спектров в ультрафиолетовой области,оптические плотности белков при 280 нм и расчет концентраций их растворов вмг/мл.

Содержание цитокинов представлено в пикограммах в пересчёте намиллиграмм белка.59 Для определения концентрации IL-28B в сыворотке крови применяли набордля иммуноферментного определения IL-28B человека ELISA Kit for Interleukin28B (Cloud-Clone Corp., USA) «сэндвич»-методом строго по протоколу фирмыпроизводителя.Для этого готовили серию разведений стандартов IL-28B путем разведениястандарта, прилагаемого в наборе. Разведение стандартов соответствовалоследующим концентрациям: 500 пг/мл, 250 пг/мл, 125 пг/мл, 62.5 пг/мл, 31.3пг/мл, 15.6 пг/мл и 7.8 пг/мл, и было необходимо для построения калибровочнойкривой.

Далее вносили по 100 мкл стандартов и образцов в соответствующиелунки, плашку закрывали адгезивной пленкой, инкубировали 2 часа при 37o C.Далее удаляли пленку, опустошали планшет и просушивали постукиванием пофильтровальной бумаге. Готовили рабочую концентрацию детектирующихреагентов. Для этого прилагаемые в наборе Detection Reagent A и DetectionReagent B разводили Assay Diluent A и Assay Diluent B, соответственно, всоотношении 1:100.Далее добавляли в лунки по 100 мкл Detection Reagent A, закрывали пленкой,инкубировали 1 час при 37oC. После инкубации удаляли пленку, в каждую лункудобавляли по 350 мкл отмывочного буфера. Отмывку повторяли 3 раза.

Затемдобавляли по 100 мкл Detection Reagent B в рабочей концентрации, закрывалипленкой и инкубировали 30 минут при 37oC. Далее пленку удаляли, плашкуопустошали и проводили отмывку отмывочным буфером 5 раз. После отмывки вкаждую лунку добавляли 90 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидазы (TMBSubstrate). Закрывали пленкой, инкубировали 25 мин при 37oC в темноте. Затемдля остановки реакции в каждую лунку добавляли по 50 мкл стоп-реагента иизмеряли оптическую плотность при 450 нм с помощью микропланшетногоридера Anthos 2020 (БиоХимМак, РФ).

Данный прибор измеряет оптическуюплотность в каждом образце, строит калибровочную кривую, исходя изконцентрации стандартов и вычисляет концентрацию цитокина IL-28B висследуемых образцах.Калибровочная кривая представлена на рисунке 9.60 Оптическая плотность, ед.ОП10,9y = 2×10-6x2 + 0,0008x + 0,09780,80,7R² = 0,99280,60,50,40,30,20,100100200300400500Концентрация стандарта IL-28B, пг/млРисунок 9.Калибровочная кривая для измерения концентрации уровняцитокина IL-28B в назальных смывах больных бронхиальной астмойДля определения концентрации IL-33 в назальных смывах и сыворотке кровиприменяли набор для иммуноферментного определения IL-33 человека.Human IL-33 Platinum ELISA (Affymetrix eBioscience, San Diego, CA, USA)согласно инструкции фирмы-производителя.

Характеристики

Тип файла
PDF-файл
Размер
1,37 Mb
Предмет
Высшее учебное заведение

Список файлов диссертации

Особенности врожденного иммунитета у детей с бронхиальной астмой
Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6367
Авторов
на СтудИзбе
310
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее