Диссертация (1174378), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Для инактивации фермента M-MuLVReverseTranscriptaseСинтезированнаянагретькДНКпробиркиможет92оСиспользоваться51 довтечении5непосредственноминут.для амплификации методом ПЦР или храниться при -20оС или -70оС болеепродолжительное время.Таблица 3. Объемы реактивов для приготовления реакционной смеси припроведении реакции обратной транскрипцииПриготовление смеси №1РеагентОбъем, мклПраймер Random-6, 15 ОЕ/мл1Праймер Oligo(dT)15, 15 ОЕ/мл1ddH2O3Общий объем смеси на 1 пробу5Приготовление смеси №2РеагентMMLV-RT, 50 ед/мкл12,5Х Реакционная смесь10ddH2O4Общий объем смеси на 1 пробу152.4.3 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времениПЦР в реальном времени (или количественная ПЦР, англ.
Real-time PCR) метод, используемый для одновременной амплификации и измерения количестваДНК. Преимуществом данного подхода является возможность совмещениядетекции и количественного определения специфической последовательностиДНК в образце в реальном времени после каждого цикла амплификации [43].52 ПЦР проводили с использованием «Набора для проведения ПЦР РВ»(«Синтол», Россия). В стерильных пробирках 1,5 мл, типа Эппендорф, готовилиПЦР-смесь, состоящую из 2 мкл dNTp 2,5 mM, 2 мкл 10xПЦР буфера, 2мкл MgCl225 mM, 1 мкл Forward primer 10 пкмоль/мкл, 0,1 мкл Reverse primer 10пкмоль/мкл, 0,3 мкл Taq ДНК-полимеразы 5Е/мкл и 3,7 мкл деионизированнойводы в расчете на 1 образец (Таблица 4).Таблица 4.
Объемы реактивов для приготовления реакционной смеси дляпроведения ПЦР-РВПриготовление смеси для ПЦР-РВОбъем, мклПрямой праймер (TLR2/TLR4/TLR9/HBD1/IL-28B/Actin),110 пкмоль/мклОбратный праймер (TLR2/TLR4/TLR9/HBD1/IL-28B/Actin),110 пкмоль/мклTaq ДНК-полимераза, 5Е/мкл0,3dNTP, 2,5 мМ2,510 х буфер SYBR Green I2,5MgCl2, 25 мМ2,5dd H2O2,5Общий объем смеси на 1 пробу12Далее в пронумерованные пробирки (200 мкл, Axygen, США) вносили по 3мкл кДНК, полученной в результате ОТ, и добавляли 12 мкл приготовленнойПЦР-смеси. Для качественной постановки помимо пробирок с клиническимиобразцами ставили отрицательный контроль, в который вместо ДНК добавляли 3мклдеионизированнойводы.Образцы53 помещаливАмплификатор детектирующий ДТ-96 («НПО ДНК-Технология», РФ) и запускали программуамплификации, которая представлена в Таблице 5.Таблица 5.
Программа амплификации для определения уровня экспрессиигенов TLR2, TLR4, TLR9№блокаТемпература,МинСекоКоличествоцикловС19510012940154062030900153100В результате реакции получали зависимости интенсивности флуоресценцииот количества циклов амплификации (рисунок 6).Рисунок 6. Зависимость интенсивности флуоресценции интеркалирующегокрасителя SYBR Green I в зависимости от времени амплификации гена TLR254 Для определения экспрессии исследуемого гена также анализировалипоказатели контрольного (референсного) гена, или гена сравнения. В качествереференсного гена был выбран "ген домашнего хозяйства"- ген актина, уровеньэкспрессии которого считается относительно постоянным в различных тканях[135].ДляопределенияспецифичностиПЦР-продукта,послереакцииамплификации проводили процедуры плавления, график которой представлен нарисунке 8.
В режиме плавления происходит повышение температуры в заданныхграницах с определенным шагом (с выдержкой времени после каждого шага) иизмерение интенсивности флуоресценции при каждой температуре. Приувеличении температуры ДНК денатурирует, в результате чего краситель SYBRGreen I переходит в раствор и перестает флуоресцировать. При достижениитемпературы плавления специфического ПЦР-продукта происходит резкоепадение интенсивности флуоресценции, так как сразу денатурирует большоеколичество ДНК и SYBR Green I массивно выходит в раствор. На графикепроизводной изменения интенсивности флуоресценции это выражается в видепика (рисунок 7).55 Рисунок 7.
Кривая плавления для определения специфичности продуктовамплификации.По оси абсцисс – номер цикла, по оси ординат – уровень флуоресценции.Продукты амплификации плавятся при температуре 82С, отрицательныеконтроли – изолиния, что свидетельствует об отсутствии в них ДНК.Определение количества копий исследуемых генов производился покалибровочным прямым, ранее разработанным на кафедре иммунологии МБФ длягенов TLR2, TLR4, TLR9, HBD1 и IL-28B.
Стандартизация результатов ПЦР-РВ,полученныхвпроцессеисследования,проводилиотносительноуровняэкспрессии гена β-актина.Длякаждогообразцаполучализначениелогарифмачислакопийисследуемого гена (TLR2, TLR4, TLR9, HBD1 и IL-28B) и числа копий гена βактина для нормировки результатов. Количество копий определяемого гена вдальнейшем пересчитывалось относительно 1 млн копий гена β-актина для геновTLR2, TLR4, TLR9, IL-28B и относительно 1 000 копий гена β-актина – для генаHBD1.Число копий исследуемого гена рассчитывалось по формуле (на примерегена IL-28B):56 N=10log (IL-28B) – (log (β-актин)-3), где N – число копий гена. Данная формулаприменима для определения количества копий генов TLR2, TLR4, TLR9, HBD1 иIL-28B.Параллельно с этим анализ результатов проводили относительнымметодом измерений по DDCt, получая результаты в виде относительных единицRQ (relative quantity), показывающих во сколько раз больше или меньшеэкспрессия гена-мишени в исследуемом образце по отношению к референсномуобразцу [20].
В качественно гена эндогенного контроля был использован ген βактина.Для использования этого метода необходимы следующие условия:1. Эффективности реакций амплификации исследуемых генов и генаэндогенного контроля (ген «домашнего хозяйства») должны бытьодинаковыми (могут отличаться не больше, чем на 5%) и составлять95±5%.2.
Необходимо чтобы экспрессия гена эндогенного контроля не отличаласьбольше, чем на 5-7 циклов (или Ct) от исследуемого гена или былаодинаковой с ним (чтобы экспрессия была сравнима).3. Необходимо так подобрать концентрацию исследуемых образцов чтобыони давали сигнал (Ct - порог насыщения реакции (cycle threshold),определяется как точка пересечения графика накопления ДНК и пороговойлинии) на 20-25 цикле.4. Необходимо проводить нормировку по концентрации РНК, используемойв эксперименте.2.5 Оценка экспрессии TLR2, TLR4 на лейкоцитах периферическойкрови методом проточной цитометрииИзучение экспрессии TLR2 и TLR4 на лейкоцитах периферической кровиоценивали проводили методом проточной цитофлуорометрии.
Работу проводилисовместно с ассистентом кафедры иммунологии Огурцовой А.Д. Для этого 10057 мклцельнойкровиинкубироваливтечение10минутсмеченымимоноклональными антителами. Затем осуществляли лизис эритроцитов. Для этогов каждую пробирку добавляли 900 мкл лизирующего раствора IOTest 3LysingSolution (BeckmanCoulter, США). После чего образцы инкубировали втермостате при температуре 37°С в течение 9 мин.
Далее клетки дваждыотмывали при 1000 об/мин в растворе Хенкса. Анализ образцов проводили напроточном цитофлуориметре Beckman Coulter Navios (BeckmanCoulter, США). Вкаждом образце было проанализировано не менее 100000 событий. Дляидентификации клеток использовали следующие моноклональные антитела:CD14, меченые APC («e-Biosciences»), CD45, меченые ECD («e-Biosciences»),СD282 (TLR2) и CD 284 (TLR4), меченые Alexa Fluor 488 («e-Biosciences»),изотипический контроль Mouse IgG2a, меченые Alexa Fluor 488 («e-Biosciences»).Анализ образцов проводили на проточном цитометре «Navios» (Beckman coulter,Inc.).ДлякаждогообразцабылопределенпроцентСD14+-моноцитов,лимфоцитов и гранулоцитов, несущих TLR2 или TLR4, а также среднююинтенсивность экспрессии (СИФ) этих рецепторов на клетках периферическойкровиубольныхБАиздоровыхдоноров.Среднююинтенсивностьфлуоресценции рассчитывали, как отношение интенсивности флуоресценцииобразца к интенсивности флуоресценции изотипического контроля:СИФ=СИФ образца / СИФ изотипического контроля58 Рисунок 8.
Средняя интенсивность экспрессии TLR2 на CD14+ моноцитах(слева) и TLR4 на гранулоцитах (справа)2.6 Определение цитокинов (IL-28B, IL-33, IL-4, TSLP) методомиммуноферментного анализаВ качестве материала исследования были использованы смывы со слизистойоболочки полости носа и сыворотка крови пациентов с БА и здоровых детей.Перед исследованием все пробы доводили до комнатной температуры (18-25°С),аккуратноперемешивалиипроводилиоценкусодержаниябелканамикроспектрофотометре NanoDrop™ 2000. В качестве контрольного раствораиспользовали ddH2O. На пьедестал микроспектрофотометра микропипеткойвносили 1 мкл назального смыва или сыворотки крови и с помощью программыProtein A280 получали изображения спектров в ультрафиолетовой области,оптические плотности белков при 280 нм и расчет концентраций их растворов вмг/мл.
Содержание цитокинов представлено в пикограммах в пересчёте намиллиграмм белка.59 Для определения концентрации IL-28B в сыворотке крови применяли набордля иммуноферментного определения IL-28B человека ELISA Kit for Interleukin28B (Cloud-Clone Corp., USA) «сэндвич»-методом строго по протоколу фирмыпроизводителя.Для этого готовили серию разведений стандартов IL-28B путем разведениястандарта, прилагаемого в наборе. Разведение стандартов соответствовалоследующим концентрациям: 500 пг/мл, 250 пг/мл, 125 пг/мл, 62.5 пг/мл, 31.3пг/мл, 15.6 пг/мл и 7.8 пг/мл, и было необходимо для построения калибровочнойкривой.
Далее вносили по 100 мкл стандартов и образцов в соответствующиелунки, плашку закрывали адгезивной пленкой, инкубировали 2 часа при 37o C.Далее удаляли пленку, опустошали планшет и просушивали постукиванием пофильтровальной бумаге. Готовили рабочую концентрацию детектирующихреагентов. Для этого прилагаемые в наборе Detection Reagent A и DetectionReagent B разводили Assay Diluent A и Assay Diluent B, соответственно, всоотношении 1:100.Далее добавляли в лунки по 100 мкл Detection Reagent A, закрывали пленкой,инкубировали 1 час при 37oC. После инкубации удаляли пленку, в каждую лункудобавляли по 350 мкл отмывочного буфера. Отмывку повторяли 3 раза.
Затемдобавляли по 100 мкл Detection Reagent B в рабочей концентрации, закрывалипленкой и инкубировали 30 минут при 37oC. Далее пленку удаляли, плашкуопустошали и проводили отмывку отмывочным буфером 5 раз. После отмывки вкаждую лунку добавляли 90 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидазы (TMBSubstrate). Закрывали пленкой, инкубировали 25 мин при 37oC в темноте. Затемдля остановки реакции в каждую лунку добавляли по 50 мкл стоп-реагента иизмеряли оптическую плотность при 450 нм с помощью микропланшетногоридера Anthos 2020 (БиоХимМак, РФ).
Данный прибор измеряет оптическуюплотность в каждом образце, строит калибровочную кривую, исходя изконцентрации стандартов и вычисляет концентрацию цитокина IL-28B висследуемых образцах.Калибровочная кривая представлена на рисунке 9.60 Оптическая плотность, ед.ОП10,9y = 2×10-6x2 + 0,0008x + 0,09780,80,7R² = 0,99280,60,50,40,30,20,100100200300400500Концентрация стандарта IL-28B, пг/млРисунок 9.Калибровочная кривая для измерения концентрации уровняцитокина IL-28B в назальных смывах больных бронхиальной астмойДля определения концентрации IL-33 в назальных смывах и сыворотке кровиприменяли набор для иммуноферментного определения IL-33 человека.Human IL-33 Platinum ELISA (Affymetrix eBioscience, San Diego, CA, USA)согласно инструкции фирмы-производителя.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
