Диссертация (1174378), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Для этого аналогичным образомготовили разведение стандартов (500 пг/мл, 250 пг/мл, 125 пг/мл, 62.5 пг/мл, 31.3пг/мл, 15.6 пг/мл, 7.8 пг/мл) и вносили по 100 мкл стандартов и образцов всоответствующие лунки, плашку закрывали пленкой, инкубировали 2 часа прикомнатной температуре (20OC) на шейкере для микропланшетов при 400 об/мин.После инкубации удаляли пленку, в каждую лунку добавляли по 400 мклотмывочного буфера. Отмывку повторяли 6 раз. Затем добавляли по 100 мклконъюгата биотина в рабочей концентрации, закрывали пленкой и инкубировали1 час при температуре 20OC на шейкере для микропланшетов при 400 об/мин.После инкубации вновь удаляли пленку и проводили отмывку 6 раз с помощьюотмывочного буфера. Далее добавляли 100 мкл Streptavidin-HRP в рабочейконцентрации, закрывали пленкой и вновь инкубировали 1 час при 20OC нашейкере при 400 об/мин.
Далее пленку удаляли, плашку опустошали и проводили61 отмывку отмывочным буфером 6 раз. После отмывки в каждую лунку добавляли100 мкл TMB Substrate Solution, закрывали пленкой, инкубировали 30 мин при20oC в темноте.Для остановки реакции в каждую лунку добавляли по 100 мкл стоп-реагентаи измеряли оптическую плотность при 450 нм на микропланшетном ридереAnthos 2020 (БиоХимМак, РФ).
Калибровочная кривая для определенияконцентрации IL-33 представлена на рисунке 10.Оптическая плотность, ед.оп.3,5y = -3×10-6x2 + 0,0075x + 0,09753R² = 0,99972,521,510,50050100150200250300350400450500Концентрация стандарта IL-33, пг/млРисунок 10. Калибровочная кривая для измерения концентрации IL-33 вназальных смывах и сыворотке крови больных бронхиальной астмойАналогичным способом для определения концентрации IL-4 и TGF-β1 вназальных смывах и сыворотке крови применяли наборы для иммуноферментногоанализа Human IL-4 Platinum ELISA, Human TGF beta 1 Platinum ELISA(Affymetrix eBioscience, San Diego, CA, USA) согласно инструкции фирмыпроизводителя.С целью количественного анализа TSLP в смывах из полости носа исыворотке крови применяли набор Quantikine ELISA Human TSLP Immunoassay(R&D systems, USA).62 2.7 Определение про- и противоспалительных цитокинов методоммультиплексного иммунофлюоресцентного анализа в назальных смывахДля определения содержания цитокинов (IL1-b, IL-1-Ra, IL-6, IL-8, IL-10,TNF-α) в назальных смывах проводили мультиплексный иммунофлюоресцентныйанализ (Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader, USA), с помощью набора Bio-Plex ProAssaysстрогопопротоколуфирмы-производителя.Технологиямультиплексирования MAGPIX основана на использовании наборов магнитныхмикросфер d 5,6 мкм, которые являются носителями флуоресцентных веществ.
Наповерхности микросфер располагаются молекулы, обладающие свойствомспецифического взаимодействия с анализируемыми молекулами по принципуобразования комплекса антиген – антитело. Сами частицы в момент считываниянаходятся в иммобилизованном состоянии и удерживаются магнитами, т.е.частицы располагаются в одной плоскости, что позволяет сделать считываниеболее эффективным.Благодаря «цветовой» кодировке сфер, данная методика позволяет проводитьмультиплексный анализ и определять до 50 различных мишеней в одном образце.Детекция иммунных комплексов и самих микросфер осуществляется при помощирегистрациифлуоресценцииCCD-камерой,котораядетектирует свечениефлуорофоров самой сферы и свечение иммунного комплекса.2.8 Статистическая обработка результатовСтатистическую обработку данных проводили с использованием методовнепараметрической статистики, в связи с ненормальным распределениемвыборки, разным числом наблюдений в каждой из групп при помощи программыExcel и STATISTICA 6.0.
Данные представлены в виде Ме (25%-75%), где Ме –медиана, (25%-75%) – нижний и верхний квартиль. Для анализа статистическойзначимости использовали критерий Манна-Уитни, различия между группамисчитались достоверными при p<0,05. Корреляционный анализ проводился сприменением коэффициента ранговой корреляции Спирмена [10, 127].63 Глава 3. Результаты и обсуждениеСлизистаяоболочкареспираторноготрактапредставляетнетолькофизиологический барьер, но и является полноценным участником мукозальногоиммунитета. Эпителий верхних и нижних дыхательных путей имеют общиемаркеры активации.
Показано патогенетическое единство верхнего и нижнегоотделов респираторного тракта, особенно при аллергопатологии. Важнымкомпонентом эпителиальной защиты во врожденном иммунитете являетсяподдержание барьерной функции за счет распознавании патогенов и аллергенов,секреции цитокинов и противомикробных пептидов.Показано, что эпителиальные клетки, экспрессирующие распознающиерецепторы,вырабатываютинтерферонипротивомикробныепептиды,обеспечивая защиту слизистых от патогенов.Перед нами стояла задача исследовать показатели врожденного иммунитетана уровне слизистой оболочки полости носа и на системном уровне у детей с БАразличной степени тяжести.
Для этого был разработан комплексный подход коценке врожденного иммунитета на уровне слизистой оболочки полости носа,включающаяэффекторныхоценкураспознающихмолекулрецепторов(противомикробногоTLR2,пептидаTLR4,TLR9иHBD1,про-ипротивовоспалительных цитокинов).3.1 Особенности экспрессия генов TLR2, TLR4, TLR9 и HBD 1 в клеткахслизистой оболочки полости носа у детей с бронхиальной астмой различнойстепени тяжести Изменение экспрессии генов TLR2, TLR4, TLR9 у детей с бронхиальнойастмойУчитывая тот факт, что вирусная и бактериальная инфекции являютсятриггерами приступа и обострения астмы, обосновано исследование экспрессиигенов паттернраспознающих рецепторов.
Более информативным представляется64 оценка экспрессии TLR2, TLR4 и TLR9 т.к. данные рецепторы распознаютширокий спектр PAMP. В частности, TLR2 активируется в ответ на PAMPграмположительных бактерий, микоплазм и дрожжей, а TLR4 распознаетграмотрицательные бактерии, белки теплового шока и аллергены. Рецептор TLR9распознает нуклеиновые кислоты, обогащённых неметилированными CpGпоследовательностями.В исследование были включены дети с БА в возрасте от 3 до 12 лет.Первоначально дети были разделены на две возрастные группы, дошкольный от 3до 5 лет и школьный от 6 до 12 лет.
Важно отметить, что при оценке показетелtйврожденного иммунитета у детей разных возрастных групп были полученысопоставимые данные. Так у пациентов в возрастной группе от 3-5 лет с тяжелойстепенью БА экспрессия гена TLR2 в виде относительных единиц составила1,2(1,15;1,26), а в группе детей от 6 до 12 лет – 1,14 (0,5;4,9), что в 6,8 и 6,4 раза21,8А1,61,41,210,80,60,4В1,210,80,60,40,20,201,4Количество мРНК, отн.ед.Количество мРНК, отн.ед.соответственно превышает показатели нормы (рисунок 11).Легкая БА Средняя БА Тяжелая БА0Легкая БА Средняя БА Тяжелая БАРисунок 11. Изменение показателей врожденного иммунитета у детей с БАразличной степени тяжести в разных возрастных группах.А – экспрессия гена TLR2 в соскобах со слизистой полости носа;B – экспрессия гена TLR9 в соскобах со слизистой полости носа;Примечание: по оси абсцисс исследуемые группы; по оси ординат количествомРНК в относительных единицах.Данные представлены в виде медианы (25%; 75 %)65 Аналогично с данным примером не обнаружено значимых различий прианализе показателей другими исследуемыми показателями.
Таким образом небыло выявлено корреляции между возрастом пациента и изменением экспрессииисследуемых генов, что подтверждается единообразием этиологических факторови клинической картины у детей с БА вплоть до пубертата. Объединив группы повозрастам получены данные, указанные ниже.Экспрессия гена TLR2 в группе детей с легкой степенью тяжести БАповышена в 2,6 раз, но не являлась достоверной. В группах со средней и тяжелойастмой также выявлено значительное повышение экспрессии гена TLR2 в 5,6 и6,5 раза соответственно по сравнению с группой здоровых детей (р≤0,01)(рисунок 12).Количество мРНК, отн.ед.43,5р≤0,013Здоровые дети2,5Легкая БА2Средняя БА1,5Тяжелая БА10,50Рисунок 12.
Экспрессия гена TLR2 в клетках слизистой полости носа у здоровыхдетей и детей больных бронхиальной астмой различной степени тяжестиПримечание: по оси абсцисс исследуемые группы; по оси ординат количествомРНК в относительных единицах.Данные представлены в виде медианы (25%; 75 %)66 Суммируя полученные результаты можно предположить, что TLR2 играетзначительную роль в патогенезе БА у детей, поскольку этот показательдостоверно растет в группах с средней и тяжелой степенью астмы.В соскобах со слизистой полости носа у пациентов с легкой и среднейстепенью БА выявлена тенденция к увеличению экспрессии гена TLR4.
В группес тяжелой БА отмечается достоверное повышение экспрессии гена в 2,5 раза(p≤0,05) (рисунок 13).2,5Количество мРНК, отн.ед.р≤0,052Здоровые дети1,5Легкая БАСредняя БА1Тяжелая БА0,50Рисунок 13. Экспрессия гена TLR4 в клетках слизистой полости носа у здоровыхдетей и детей больных бронхиальной астмой различной степени тяжестиПримечание: по оси абсцисс исследуемые группы; по оси ординат количествомРНК в относительных единицах.Данные представлены в виде медианы (25%; 75 %)При оценке экспрессии гена TLR9 в группе с легкой степенью тяжести БА невыявлено различий относительно здоровых детей.
В группе с астмой среднейстепени тяжести экспрессия гена TLR9 в 2,6 раз превышал уровень экспрессииTLR9 в контрольной группе (p≤0,05). У пациентов с тяжелой степенью БА,выявлено повышение экспрессии гена TLR9 в 2,5 раза по сравнению с контролем(p≤0,05) (рисунок 14).67 Количество мРНК, отн.ед.1,2p≤0,05 10,8Здоровые детиЛегкая БА0,6Средняя БА0,4Тяжелая БА0,20Рисунок 14. Экспрессия гена TLR9 в клетках слизистой полости носа у здоровыхдетей и детей больных бронхиальной астмой различной степени тяжестиПримечание: по оси абсцисс исследуемые группы; по оси ординат количествомРНК в относительных единицах.Данные представлены в виде медианы (25%; 75 %)Сравнивая показатели экспрессии генов распознающих рецепторов междугруппами больных БА было выявлено, что тяжесть течения заболеваниякоррелирует с уровнем экспрессии.
Стоит отметить, что у пациентов с тяжелойБА в 33% случаев выявлено повышение экспрессии гена TLR2 более чем в 10 раз.Аналогично у 26% пациентов отмечается гиперэкспрессия гена TLR4 и у 13%гена TLR9.В нашем исследовании показано выраженное повышение экспрессии геновраспознающих рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9) в клетках слизистой оболочкиполости носа. Полученные данные подтверждают результаты исследования D.S.Ferreira с соавторами, которые обнаружили существенное увеличение экспрессиимолекул рецепторов TLR2, TLR3 и TLR4 на эпителиальных клетках дыхательныхпутей пациентов с тяжелой степенью БА с помощью иммуногистохимическогометода [62].68 Также подтверждением роли TLRs в формировании астмы являютсямногочисленные исследования полиморфизмов их генов [116, 155, 158].Генетические полиморфизмы TLRs могут отвечать за тяжесть БА.
Полиморфизмыв гене TLR4 влияют на чувствительность к аллергенам [164, 169]. Zhang et al.обнаружили негативное влияние аллель гомозигот TT в гене TLR4 rs1927914 наОФВ1, что подразумевает нарушение функции легких [169]. Кроме того, генотипАА гомозиготы и аллель А в Asp299 Gly гена TLR4 могут коррелировать суменьшеннымрискомастмы,очемсвидетельствуетсвязьмеждуполиморфизмами TLR4 и развитием астмы в исследовании Tizaoui et al. [151] Вдополнение к TLR4, варианты TLR2 гена, как сообщается, имеют некоторуюсвязь с БА у детей на Кавказе [101].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
