Диссертация (1174352), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Затем чип отмывают в 1× SSPE в течение 10 мин прикомнатной температуре и высушивают. Флуоресцентный сигнал от ячеек биочипарегистрировали с помощью портативного анализатора биочипов, снабженногокамерой ПЗС и программным обеспечением Imageware (―БиочипИМБ‖, Россия).Пример картины гибридизации и результат генотипирования образцаприведен на рисунке 3.3738Рисунок 3. Картина гибридизации и генотипы образца.Секвенирование. Правильность определения генотипов для каждоговарианта полиморфизма подтверждали прямым секвенированием по Сэнгеру.Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISMBigDye Terminator v.3.1 с последующим анализом продуктов реакции наавтоматическом секвенаторе 3730 DNA Analyzer (―Applied Biosystems‖, США).Статистический анализДля обработки данных использовали программу STATISTICA 6.0,позволяющуюприменитьпрограммуMDRмногомерныйстатистический(MultifactorDimensionalityhttp://www.multifactordimensionali-tyreduction.org).вариантовгеновсклиническимиметод,признакамиАссоциациюоценивалиатакжеReduction,полиморфныхприпомощидвустороннего точного теста Фишера с использованием интерактивной таблицысопряженности.
Вычисляли значения ОШ (odds ratio, отношение шансов) с 95%3839доверительным интервалом (95% ДИ). Критический уровень статистическойзначимости p принимали равным 0,05.Был произведен расчет статистической мощности данного исследования(табл.3):Таблица 3.Расчет статистической мощности исследованияДоверительнаявероятность %ПациентысИИ (клиника)ПациентысИИ (генетика)ПациентысХИМ(клиника)ПациентысХИМ(генетика)95Доверительный Генеральная Требуемыйинтервал +-%совокупность размервыборки51781229556959955846995584693940Глава 3Клинико-генетический анализ3.1 Клинико-генетический анализ больных хронической ишемией мозгаБыли проанализированы клинические данные исследуемой группы, вкоторую вошли 81 пациент. Страдают артериальной гипертензией 55 пациентов(67,9%), из них кризовое течение болезни отмечается у 8 пациентов(9,9%),медленно прогрессирующее у 43(53%), быстро прогрессирующее – 9(11%).Пониженные цифры артериального давления определены у 11 (13,6%)исследуемых, 14 пациентов (17,3%) не отмечали ранее эпизодов подъема АД.Наличие состояния стресса и тревожности отмечают 35 (43%) пациентов, изних 20 страдают АГ.
Длительное курение (более 20 лет) у 9 (11%) пациентов.При сборе анамнестических данных 19 исследуемых отмечают наличиеперенесенных инсульта и инфаркта у ближайших родственников. Хроническаяишемия головного мозга 1 и 2 степени отмечена в 34 случаях и в 39 случаяхсоответственно. Излишний вес отмечен у 10 пациентов (12%). При анализеклинических симптомов выяснено, что цефалгический синдром наблюдался у -24(29,6%), вестибулопатия – 27 (33%), астенический синдром – 21 (25,9%),когнитивные нарушения – 21 (25,9%), мнестические нарушения – 18 (22,2%)пациентов.Все пациенты с цереброваскулярной патологией были разделены на 2группы: группа пациентов, страдающих АГ, и группа пациентов с гипо- инормотонией.Присравнениивлиянияфактороврискаразвитияцереброваскулярной патологии в двух группах пациентов выявлено: состояниестресса в 1 группе отмечают 23 пациента (28%), во 2 группе- 12 (14,8%);гиподинамия в 1 группе встречается в 10 (12%) случаях, во 2 группе- 2(2,5%);наличие избыточного веса отмечено у 6 (7,4%) и 4 (4,9%) пациентовсоответственно.4041При оценке клинических проявлений в 1 группе наличие вегетативнойсимптоматики (симпато-адреналовый тип) отмечается у 9 (11%) пациентов и 2(2,5%) во 2 группе; цефалгический синдром в 1 группе встречается в 22% случаев(18 пациентов) и в 7,4% (6 пациентов) во 2 группе.
Астенический синдром – в17,3% (14 пациентов)и 8,6% (7 пациентов) соответственно, состояниетревожности в 1 группе у 18 (22%) и 7 (8,6%) во 2 группе, когнитивное снижениеотмечено у 15 пациентов (18,5%) и 6 (7,4%) соответственно,мнестическиенарушения в 18,5% (15 пациентов) и 3,7% (3 пациента) случаев, вестибулопатия вобеих группах на уровне 6%. (табл. 4)Таблица 4.Анализ симптомовСимптомЦефалгическийГруппа 1 (n=67)Группа 2 (n=14)22%(18)7,4% (6)17,3% (14)8,6% (7)Тревожность22% (18)8,6% (7)Когнитивно-18,5% (15)3,7% (3)Вестибулопатия6% (5)6% (5)Анизорефлексия16% (13)8% (7)Рефлексы8% (7)5% (4)симптомАстеническийсимптоммнестическиенарушенияоральногоавтоматизма4142Генетический анализ пациентов с ХИМРезультаты генотипирования с помощью тест-системы на основе биочиповпациентов с хронической ишемией головного мозга представлены в таблице 5.Таблица 5.Распределение генотипов в группе пациентов с хронической ишемиейголовного мозгаГенгенотипы (n)NPIDГенгенотипы(n)NPIDГенгенотипы(n)NPIDFGBSrs1800790F5F7F12PAI-1GPIbaGPIIIACYP11B2rs6025rs6046rs1801020rs1799768rs2243093rs5918rs1799998G/G42G/G76G/G58C/C34425T/T71T/T53T/T22G/A36G/A5G/A21C/T35442T/C9T/C23T/C36A/A3A/A0A/A2T/T12514C/C1C/C5C/C23G/4GG/5GACESrs1799752MTHFRPON1PON2G/5GNOSrs1801133rs662rs1801282I/I21C/C48A/A47C/CI/D41C/T27A/G30D/D18T/T6G/G4NOS3LTArs2297518rs1799983rs90925342C/C51G/G46A/A37C/G32C/T28G/T29A/G38G/G7T/T2T/T6G/G6обработанысPDE4DSrs966221PDE4DHIF1aHIF1aALOXrs2910829rs11549465rs11549467rs4769874C/C38C/C17C/CI/II/I78G/G70C/T27C/T35C/TI/DI/D3G/A11T/T16T/T29T/TD/DD/D0A/A0Данныегенотипированиябылииспользованиемиерархического кластерного анализа.
Пациенты с хроническим нарушениеммозгового кровообращения образовали две группы, в каждую из которых былиобъединены пациенты с определенными сочетаниями аллелей исследованныхгенов (рис.4). В первую группу вошло 45 пациентов, во вторую – 36.4243Рисунок 4. Результаты кластерного анализа генетических данных больных схронической ишемией головного мозга.4344По факторам риска80%75%62%60%40%20%28%15% 12%3%7%5%1гр.2гр.0%Рисунок 5. Сравнение пациентов 1 и 2 групп по факторам риска развитияХИМ.При анализе клинических картин пациентов двух групп, выделенных порезультатам кластерного анализа генетических данных, можно отметить, что вобеих группах доля пациентов, страдающих артериальной гипертензией,составляет62% и 75%, соответственно (рис.5).
Преобладающее количествопациентов имеют медленное прогрессирующее течение АГ 57,8% и 50%, однако вгруппе 2 у 22% больных отмечается быстрое прогрессирующее течение АГ, чтоявляется статистически значимым фактором (р<0,05), так же отмечаетсянесколько большее количество больных с кризовым течением АГ- 4% против11%.Можно отметить, что в группе 2 чаще регистрируются головная боль,астенические и вегетативные нарушения, но при статистической обработкеданная разница не была значимой, вероятно, из-за малой выборки (рис.6).В группе 2 отмечается преобладание ХИМ 2 ст.-52,8%, тогда как в группе 1преобладает ХИМ 1 ст.-44%.
Учитывая результаты клинических наблюдений,4445анализа генетических данных можно сделать вывод о распределении пациентовпо группам в зависимости от прогредиентности течения АГ.Рисунок 6. Сравнительная характеристика клинических симптомов упациентов 1 и 2 групп.Также был проведен анализ распределения генотипов для каждого изисследуемых полиморфных маркеров в двух группах больных. Статистическизначимых различий в частоте встречаемости генотипов генов ACE, SERPINE1,FGB, F5, F7, F12, GP1BA, GPIIIa,, MTHFR, CYP11B2, PON1, PON2, NOS2, NOS3,HIF1a, LTA, ALOX5AP, TUB в двух группах пациентов выявлено не было.
Прианализе распределения генотипов гена PDE4D были выявлены различия дляSNP83 C>T (rs966221). Так генотип С/C чаще выявляли у пациентов группы 1(68% против 19%), в то время как генотипТ/Т чаще встречался у пациентовгруппы 2 (42% против 2%), различия статистически достоверны (р=0,0001) (рис.7). Так как для группы 2 характерно быстрое прогрессирующее течение АГ,можно предположить, что генотип Т/Т является фактором риска прогредиентногоразвития АГ.
Для проверки этого предположения провели сравнительный анализ4546генотипов гена PDE4D у пациентов с быстрым или кризовым течением ипациентов с медленным течением или отсутствием заболевания в общей выборкепациентов с хронической ишемией мозга. Генотип T/T чаще встречался упациентов с прогрессирующим течением АГ (8/17) по сравнению с пациентами смедленным течением АГ или гипо- и нормотонией (8/56) в общей выборке (81пациент). Полученные различия статистически значимы (ОШ=6,22; ДИ=1,8620,79; p=0,0036).Рисунок 7. Распределение генотипов гена PDE4D в двух группах пациентовс хронической ишемией головного мозга.Это позволяет рассматривать генотип Т/Т SNP83C>T гена PDE4D вкачестве фактора риска прогредиентного течения АГ, а также хроническойишемии мозга, в целом, так как артериальная гипертензия является одним изосновных модифицируемых факторов риска развития ХИМ.Ген PDE4D кодирует фосфодиэстеразу, фермент, относящийся к семействуметаллофосфогидролаз, которые регулируют внутриклеточное соотношениециклических аденозинмонофосфата (цАМФ) и гуанозинмонофосфата (цГМФ) засчѐт их расщепления до 5’-монофосфатного нуклеотида.
Увеличение уровнявнутриклеточного цАМФ повышает электрическое сопротивление эндотелия засчет стабилизации межклеточных контактов, за счет этого уменьшаетсяпроницаемость гематоэнцефалического барьера [138]. Показано, что ген PDE4Dэкспрессируется в большинстве типах клеток и тканей разных систем органов, в4647том числе мозг, легкие, почки, моноциты, B- и T-лимфоциты, а также сосудистыегладкомышечные клетки и активированные макрофаги [213]. Белок PDE4Dпринимает участие в процессах воспаления при атерогенезе и может приводить кнестабильности атеросклеротической бляшки [100].Таким образом, уровень ферментативной активности PDE4D может игратьважную роль в формировании риска развития сосудистых заболеваний головногомозга посредством участия белкового продукта в воспалительной реакции,формировании физиологического ответа на повреждение сосудов, ангиогенезе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
