Диссертация (1174352), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Врезультате проведенных экспериментов было показано, что PON2, также как иPON1, обладает антигипоксантными свойствами. Одним из компенсаторноадаптационных механизмов, направленных на защиту клетки от повреждающегодействиясвободныхрадикаловявляетсяповышениеэкспрессиигенапараоксаназы 2. Полиморфный вариант 311S был ассоциирован с более низкимриском ИБС и инсульта.24Ген АРОЕ (rs1799820) кодирует аполипопротеин Е, который синтезируетсяв печени и головном мозге и играет существенную роль в метаболизме липидов. Вголовном мозге АроЕ необходим для доставки холестерина от глиальных клетокмозга до нейронов.
Носительство «дикого» аллеля -491А является факторомпредрасположенности к ишемическому инсульту. Соответственно, носительствогенотипа Т/T связано с устойчивостью к ИИ [115].Ген PDE4D (rs152312, rs2910829) кодирует фосфодиэстеразу 4D,которая является членом большого семейства белков. Показана ассоциацияполиморфизма rs966221 с предрасположенностью к инсульту. В исследованииWoo с соавт., найдена ассоциация полиморфизма rs2910829 гена PDE4D с рискомразвития инсульта как среди белого, так и среди темнокожего населения.Ген ALOX5AP кодирует белок, активирующий 5-липоксигеназу. По даннымавторовAngleton P., Buyru N., Catto A.J.
и др. полиморфизм rs4769874 генаALOX5AP является возможным фактором риска развития острого инсульта [85,105,119,144].К настоящему времени в отечественной и зарубежной литературе изученаобширнаягруппагенетическихмаркеров,большинстворезультатовпротиворечиво и часто не подтверждаются в повторных исследованиях и/или надругих выборках. Это связано как с мультифакторной природой заболевания,включающей в т.ч. действие неустановленных факторов, так и с различиями игетерогенностью исследуемых групп населения.комплексагенетическихфакторов,Одновременный анализассоциированныхсрискомразвитияишемического инсульта, позволит определить лиц, наиболее подверженныхзаболеванию,сцельюпроведениясвоевременныхпрофилактическихмероприятий, направленных на снижение риска возникновения различныхподтипов ишемического инсульта[12].В современной научной практике необходим принципиально новый подходкповедениюклинико-генетическогоанализа.Целесообразнопроведениемолекулярно-генетических исследований с опорой на тщательно отобранныеклинические критерии.
Одновременное исследование множества генов у25пациентовсмультифакториальнымипредрасположенности,заболеваниямииоценкунеобходимо осуществлять при условиях строгойдифференированной выборки клинических групп. Это позволить производитьнаиболее качественный клинико-генетический анализ предрасположенности кмультифакторному заболеванию, а также прогнозировать характер течениязаболевания, что увеличивает его профилактическую ценность в группах сразличной степенью риска.26ГЛАВА 2МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1 Клинические методы исследования. Экспериментальная часть(Схема 1)Последние десятилетия ознаменованы значительными успехами в областимолекулярно-генетических исследований генома человека, которые позволили отформального описания законов наследования шагнуть на новый уровень кнаиболееполнойПониманиеинтерпретацииосновополагающих(расшифровке)процессовчеловеческогогенетическогогенома.контроляметаболических механизмов в организме изменяет общие представления обэтиологии и устоявшихся молекулярных основах патогенеза моногенныхнаследственных заболеваний, так и отдельных состояний, определяющихпредрасположенность индивида к наиболее распространенным полигенныммультифакториальным заболеваниям.
В то же время потениирует развитие новыхтеорий, призванных объяснить различную индивидуальную чувствительность кнеблагоприятным факторам эндогенной среды, инфекционным агентам ифармакологическимлекарственнымпрепаратам.Изучениеполиморфизмовотдельных генов имеет большое перспективное значение при тщательномподборе клинических групп пациентов, дифференцированном сопоставлении склиническими проявлениями мультифакторного заболевания, а также основнымифакторамиразработкойриска.Толькодифференцированныйиндивидуальныхперсонализированныегенетическихметодылечения,картклиническийпозволитпрофилактикиподходсразработатьзаболеванийииндивидуальной, генетически обоснованной фармакотерапии.Наиболее актуальной проблемой современной молекулярной биологии имедицинскойгенетикиявляетсяразработкаметодических(биочипы)иметодологических основ современного анализа генетического полиморфизмачеловека для использования в персонифицированной медицине.27Микрочипы (microarrays) достаточно широко применяются в самых разныхобластях науки: молекулярной биологии, биомедицины, генетики, онкологии.Существует несколько технологических платформ, на основе которых создаютсябиологические микрочипы.
Наиболее известной является технология AffymetrixGeneChip (Santa Clara, CA, США). Микрочипы Affymetrix включают около 100индивидуальных элементов (зондов) и используются для одномоментного анализаболее 200 000 полиморфных ДНК маркеров. Особенностью данных микрочиповявляется то, что синтезирование олигонуклеотидных зондов происходит прямо наповерхности кварцевых стекол методом фотолитографии.
Также существуютмикрочипы,которыесодержатнатвердойподложке предварительновыделенные или синтезированные фрагменты ДНК. В исследовательских целяхприменяютсямикрочипы,содержащиебольшоеколичествоэлементов.Выявление ограниченного набора генетических маркеров, используемого вдиагностических целях, представляет переход к микрочипам обоснованным, исодержащит десятки или одну - две сотни элементов. В этих случаях прменяютмикроскопические стекла с нанесенными и ковалентно пришитыми зондами.Особенностьютехнологиигидрогелевых биочипов являетсятрехмернаяструктура ячеек геля, в которых иммобилизованы зонды (фрагменты ДНКили белки) [9,46].
Технология гидрогелевых биочипов развивается в Институтемолекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН с 1989 г. и является удобной инадежной платформой для разработки тест-систем для анализа полиморфизмагенома человека.Метод генотипирования с помощью таких тест-систем основан надвухэтапной гнездной ПЦР с последующей гибридизацией на гидрогелевыхбиочипах [25].
В ходе первого этапа ПЦР происходит наработка интересующихучастков исследуемых локусов с использованием геномной ДНК человека,выделенной из крови. Полученный в ходе первого этапа ПЦР продуктиспользуется в качестве матрицы для второго этапа ПЦР, в которомосуществляется наработка преимущественно одноцепочечного (за счет 10кратной разницы в концентрациях прямого и обратного праймеров) продукта28ПЦР с одновременным включением в него флюоресцентной метки. Далееосуществляется гибридизация полученных продуктов с биочипом, после чего взависимости от полученных картин гибридизации делается вывод о генотипеобразца. Иммобилизованные в ячейках биочипа олигонуклеотиды обычно имеютдлину15-19оснований,одинизпоследовательности«дикоготипу»ПоследовательностиолигонуклеотидныхолигонуклеотидовДНК,азондовикомплементаренвторой«мутантного».условиягибридизацииподобраны таким образом, что свечение ячеек наблюдается только при полнойкомплементарности олигонуклеотидных зондов и флюоресцентно-меченныхпродуктовПЦР,чтообеспечиваетвозможностьидентифицироватьоднонуклеотидные замены (Single nucleotide polymorphism, SNP).
Принцип методааллель-специфичной гибридизации представлен на рисунке 2. Для повышениянадежности анализа ячейки биочипа продублированы.29ДНК2 раунда ПЦРФлуоресцентномеченныйПЦР-продуктNNNNNNNGNNNNNNNГибридизация на биочипеNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNGNNNNNNNIIIIIIII IIII IICIIIIIIIIФлуоресцентныйсигнал естьIIIIITСигналанетРисунок 2. Схема анализа SNP методом аллель-специфичной гибридизациина биологическом микрочипе.3031―Факторы риска острой и хронической ишемии головного мозга (клинико-генетический анализ)‖Клинические параметры:1.2.3.4.АнамнезЖалобыНеврологический статусОценка тяжести инсульта по шкалеNIHSS5. Стратификация патогенетическоговарианта ИИ согласно критериямTOASTПроспективное изучениепрогностических критериев1.2.3.4.Диагностические параметры:Пациенты схроническойцереброваскулярнойпатологиейБез ИИС ИИ1.2.3.4.5.6.7.8.Генетический анализБиохимический анализ кровиКТ, МРТ головного мозгаОценка когнитивных функций по шкалеMMSEЭКГ, ЭЭГ, УЗДГ церебральных сосудовRg органов грудной клеткиОсмотр окулистаЗаключения специалистов (кардиолог,терапевт и др.)Характер течения артериальной гипертензииХарактер течения цереброваскулярного процессаПатогенетический вариант ишемического инсультаНаличие аллелей T/T SNP83C>T гена PDE4D, аллеля С генаGP1BA, аллеля D гена АСЕ.Схема 1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
