Диссертация (1174336), страница 11
Текст из файла (страница 11)
В настоящем исследовании было проведенопрактически полное клинико-инструментальном обследование (за исключениемлабораторной оценки метаболизма соединительной ткани и проведенияденситометрии). Сумма баллов при первой степени не превышала 20, приумеренной степени ДСТ- 21-40, при выраженной - до 41 и более.59В данном исследовании, шкала Т.И.
Кадуриной была модифицированаавторомисследованияподпациентовсмуковисцидозом,конкретномодифицирован раздел оценки патологии бронхолегочной системы:1. Дискинезия/пролабирование/трахео/бронхомегалия не оценивалась уисследованных пациентов, данные патологические симптомы модифицированына кистозно-фиброзную трансформацию легких у больных с муковисцидозомоценивается в 5 баллов2. Бронхоэктатическая эмфизема Лешке - модифицирована на эмфиземулегких, развивающуюся на фоне муковисцидоза, данный признак оценивался в 4балла3. Спонтанный пневмоторакс - данный признак не был модифицирован,оценивался под таким же баллом, как и в первоисточнике – 6 баллов4.
Буллёзная эмфизема лёгких - модифицирована под буллезнуютрансформацию легких у пациентов с муковисцидозом – оценивалась в 5 баллов5. Хроническая обструктивная болезнь лёгких, была модифицирована надиффузный интерстициальный фиброз легких, муковисцидоз- опосредованный оценивался в 6 баллов.Такжебылмодифицированразделоценкисиндромапатологиисердечнососудистой системы:- добавлена такая малая аномалия развития сердца, как- открытое овальноеокно- данной патологии присваивалось 2 балла.- регургитация на клапане легочной артерии, аортальном клапанеоценивались либо каждый по 1 баллу, либо в совокупности с пролабированиемАВ клапанов I-II степени - в 3 балла.В дизайн исследования не была включена оценка состояния метаболизмасоединительной ткани (не проводилась лабораторная оценка экскрецииоксипролина,пирилинкса–D,дезоксипиридинолина,остеокальцина,гидроксилизилпиридинолина,гликозоаминогликановидр.маркеровкатаболизма соединительной ткани); и не проводилась денситометрия дляоценки степени остеопороза.
Такие признаки ДСТ как ювенильный остеохондроз60– оценивался по результатам проведения компьютерной томографии органовгрудной клетки.Клиническиепризнакилокомоторныхнарушенийоценивалисьвсоответствии с разработанными критериями:Деформация грудной клетки была диагностирована двух видов –воронкообразная (инфундибулярная, «грудь сапожника»). Выраженностьворонкообразной деформации оценивают клинически с помощью расчетногоиндекса J.Gizycka.Выделяют три степени воронкообразной деформациигрудной клетки: I степень - глубина «воронки в пределах 2 см без смещениясердца; II степень - деформация не превышает 4 см, смещение сердца - впределах 2-3 см; III - степень- деформация более 4 см, смещение сердца – свыше3 см.
ИндексJ.Gizyskaопределяетсяпо отношению наименьшего инаибольшего расстояний стерновертебрального пространства (измеренного побоковым рентгенограммам, сделанным на вдохе) между задней поверхностьюгрудины и передней поверхностью тел позвонков. Индекс 0,7-1,0 соответствуетI степени, от 0,7 до 0,5 – II, а менее 0,5 – III степени деформации грудной клетки.Килевидная грудная клетка («куриная грудь», pectum carinatum)диагностируется по увеличению передне-заднего размера грудной клетки ирезкому выступанию грудины вперед. Выделяют три типа: манубрикостальный,корпокостальный, костальный (По Г.А.Баирову и соавт.1984).Степень выраженности гипермобильности суставов оценивалась покритериям P.
Beighton [159]. Каждому исследуемому ребенку проводятся пятьтестов с обеих сторон:1. Пассивное сгибание метакарпального сустава 5го пальца на 90° в обестороны.2.Пассивное сгибание 1го пальца в сторону предплечья при сгибаниив лучезапястном суставе.3.Переразгибание обоих локтевых суставов > чем на 10°.4.При наклоне вперед при фиксированных коленных суставахплоскости ладоней пациента полностью касаются пола.61Максимальная величина показателей по результатам данного теста- 9баллов.
Показатель в 1 балл подразумевает патологическое переразгибание наодной стороне. При величине показателей от 0-5 баллов - подвижность суставовраценивается как физиологический вариант нормы; 3-5 баллов- трактуется какумеренная гипермобильность суставов, 6-9 баллов- выраженная.Впедиатрическойпрактикеотсутствуютобщепринятыенормыподвижности суставов, что во многом связано с изменчивостью этого показателяв различные периоды роста ребенка. В связи с указанным, при диагностикесиндрома гипермобильности суставов (ГМС) у детей,дополнительно ккритериям P. Beighton, использовались еще 4 диагностических теста: 1)гиперлордозпоясничногоотделапозвоночникавположениистоясрасслаблением мышц, нередко сочетающийся с hallux valgus и genu recurvatum;2) избыточная мобильность шейного отдела позвоночника (наклоны в сторону≥90°); 3) пассивное переразгибание плюснефаланговых суставов (≥90°); 4)касание стопой наружной поверхности бедра при сгибании коленного сустава.Каждый из перечисленных критериев добавляет еще по одному баллу к шкале P.Beighton.
При этом суммарный итог максимально составляет 13 баллов.Минимальная сумма для установления ГМС у детей при использованиидополнительных критериев – 6 баллов, при наличии 7–9 баллов диагностируетсявыраженная, а 10 и более баллов – резко выраженная ГМС [22].Патологияпозвоночногостолбадиагностироваласьклиническиследующим образом: отсутствие или уплощение физиологических изгибовпозвоночника считалось признаком плоской спины.Сколиоз, диагностировался клинически и рентгенологически методомКобба. Согласно Чаклину В.Д. (1965) [Чаклин В.Д. Ортопедия.
М. Медгиз. 1957г.342c] выделяют 4 степени сколиоза: I степень - изгиб позвоночника 0-50, IIстепень - 5-150, III степень - 15-800, VI степень - > 800.622.2.4 Молекулярно-генетические методы исследованияЗабор биоматериала пациентов (периферическая кровь) проводили на базеРДКБ ФГБОУ ВО РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздрава России. ГеномнуюДНК пациентов выделяли из образцов цельной крови, архивированной вБиобанке Национального медицинского исследовательского центра акушерства,гинекологии и перинатологии им.
В. И. Кулакова, с помощью комплектареагентов «ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА» (ДНК-Технология, Россия) согласноинструкции производителя. Для определения наиболее распространенныхмутаций в гене CFTR использовали комплекты реагентов «Генетиканаследственныхзаболеваний.МуковисцидозСкрин»и«Генетиканаследственных заболеваний. Муковисцидоз — редкие мутации» (ДНКТехнология, Россия). Комплекты реагентов разработаны для определения 8(F508del, dele 2,3 (21kb), 2143delT, 1677delTA, N1303K, 3849+10kbC>T, E92K,W1282X) и 16 (2184insA G542X, S1196X, R334W, 394delTT, 3944delGT, 3821delT,2789+5G>A, 621+1G>T, 2183AA>G, L138ins, R117H, 604insA, 3667insTCAA,R553X, K598ins) вариантов мутаций в гене CFTR соответственно (здесь и далееприведены тривиальные названия мутаций, определяемых в составе панелей).Для определения полиморфизмов в генах соединительной ткани использоваликомплект реагентов «Дисплазия соединительной ткани».
Гены, исследованныев панели «Дисплазия соединительной ткани» приведены в таблице 2.3. Принципработы наборов основан на методе «примыкающих проб» (kissing probes) [34] ивключает: ПЦР-амплификацию целевого участка гена, гибридизации сиквенсспецифичных зондов на продуктах амплификации и регистрацию кривыхплавления зондов в ходе температурной денатурации [4]. ПЦР и определениетемпературы плавления зондов проводили при помощи детектирующегоамплификатора DTprime («НПО ДНК-Технология»). Поиск редких и новыхвариантов CFTR проводили методом высокопроизводительного секвенированияна платформе Ion TorrentTM (Thermo Fisher Scientific, США).
Целевые участкивключали в себя кодирующие области (27 экзонов гена CFTR), интрон-экзонныеграницы и область промотера гена. Дополнительно в панель включен фрагмент63дляидентификацииинтронного3849+10kbC>Tварианта(rs75039782)патогенного значения. Для определения распространенной у представителейроссийской популяции делеции 2–3 экзонов CFTR — dele 2,3 в панель мишенейбыли добавлены области, охватывающие ее границы. Обогащение целевыхфрагментов перед секвенированием проводили методом ПЦР. В ПЦР брали неменее 10 нг геномной ДНК.
Лигирование адаптеров к ПЦР-продуктам проводилис использованием T4 ДНК-лигазы (Thermo Fisher Scientific, США) согласноинструкции производителя. Качество библиотек фрагментов ДНК определяли спомощью системы Agilent 2100 Bioanalyzer и набора Agilent High Sensitivity DNAKit (Agilent Technologies, США). Для постановки высокопроизводительногосеквенирования использовали платформу Ion PGM Next-Generation SequencingSystems (IonTorrent™, США), набор IonPGM™ TemplateOT2 400 Kit(IonTorrent™, США). Высокопроизводительное секвенирование выполняли набазелабораториимедицинскогомолекулярногенетическихисследовательскогоцентраметодовакушерства,Национальногогинекологиииперинатологии им.
В. И. Кулакова. Первичный анализ данных осуществляли спомощью программного обеспечения Torrent server 4.4.3. Выравнивание нареференсный геном версии GRCh37/hg19 выполняли с помощью программногомодуля TMAP (в референсный геном был внесен фрагмент, соответствующий«fusion ампликону», маркирующему наличие делеции CFTR- dele 2,3), дляидентификации генетических вариантов был использован программный модульTorrent Variant Caller 5.4.0.46.
Последующий анализ проводили с помощьюпрограммных модулей, разработанных авторами. Медиана покрытия целевыхучастков составила 4500 прочтений, минимальное покрытие — 500. Дляопределения патогенности использовали базу данных dbSNP Build 147, локусспецифичные базы данных «CFTR1», «CFTR2», «SeqDB-LOVD», а также данныелитературы.
Подтверждение генетических вариантов проводили методомсеквенирования ДНК по Сэнгеру (по обеим цепям) на секвенаторе ABI 3130 DNAAnalyzer (Applied Biosystems, США) с оригинальными реагентами, согласно64рекомендациям производителя. Во всех случаях были получены идентичныерезультаты генотипирования.Таблица 2.3 - Панель исследованных генов соединительной ткани, и ихполиморфизмовТи, прегионПозиция нахромосомеМиссенс18957 2325Промотор181257271промоторПромоторПромотор5406930754069658102221162Миссенс44073632ХромосомаГенИдентификатор12COL3A1rs18002551161611LAMC1TIMP2MMP2MMP2MMP3rs10911193rs2277698rs243865rs2285052rs302505820MMP9rs17576206ММР9rs39182422092 (2209)G>A(Ala698Thr)-2204 C>TA>C-1306 C>T-735 C>T-1171 5A>6A836(855) A>G(Gln279Arg)(-1562C>T)VEGFArs2010963-634 (-94) G>CПромотор4384632861VEGFAIL10rs3025039rs1800872936 C>T1082 A/G3’-UTPХромосомаГенИдентификатор1ПолиморфизмТи, прегион426IL8IL1BESR1rs4073rs1143627Rs2234693промоторИнтрон 16ESR1rs2228480Синонимичная152420 0956ESR1 1Rs9340799251 A>T-511 C>T-397 T>C (Pvull)2014 G>A(Thr594Thr)351G>A (Xbal)43860514206773062Позиция нахромосоме73740307112836810152163 335Интрон152168 381Полиморфизммиссенс1 Обозначение в базе данных dbSNP национального центра биотехнологической информации США(NationalCenterforBiotechnologicalInformation, NCBI).В таблице 2.4 приведен общий объем проведенных клинических,лабораторных и инструментальных исследований.65Таблица 2.4 - Объем проведенных исследований№Методы исследования1Клинико-генеалогический методКлинико-физиологическиеисследования(клинический осмотр, антропометрия).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
