Диссертация (1174322), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Использовался стандартный метод фиксации в 10% нейтральномформалине, заливка в парафин и дальнейшее проведение гистологических срезовпарафиновых блоков толщиной 3 мкм осуществлялось на роторном микротомеНМ355S (Thermo Scientific, Германия). Данные срезы были расправлены напредметных стеклах с последующей окраской гематоксилином и эозином. Ихизучение позволило подтвердить и уточнить патогистологический диагноз,выявить очаги эндометриоза в ткани яичников помимо эндометриоидной кисты,которая являлась поводом для оперативного вмешательства, а также отобратьпарафиновые блоки для проведения иммуноморфологического исследования.
ЭЯбыл подтвержден на основании общепринятых морфологических критериев:наличие эпителиальной выстилки кисты и/или железистых структур из клетокэндометриоидного типа (с учетом реактивных, регенераторных, дистрофических,метапластических изменений и атипии), наличие эндометриоидной стромы имакрофагов с гемосидерином в инфильтрате и/или просвете кисты. Такимобразом, в материал исследования были отобраны только те наблюдения, которыесоответствовали вышеперечисленным критериям, то есть с сохранным эпителиемэндометриоидных кист яичников.2.3.2 Иммуноморфологическое исследованиеИммуногистохимическим методом (ИГХ – метод) были исследованыотобранные 43 наблюдения, из которых 35 наблюдений были с ЭЯ (изучены счетырьмямоно-иполиклональнымиантителами)и8наблюденийсаденокарциномами яичников (изучены только с поликлональными антителами кHNF-1β).В качестве первичных использовали антитела к маркеру пролиферирующихклеток, ядерному белку Ki-67 (моноклональное антитело, клон MIB-1, DAKO,Норвегия, в разведении 1:150), ингибитору апоптоза Всl-2 (моноклональное40антитело, клон 124, Cell Marque, США, в разведении 1:250), онкопротеину р53(моноклональное антитело, клон DO7, Cell Marque, США, в готовом киспользованию разведении), белку суперсемейства транскрипционных факторов,ядерному фактору гепатоцитов-1beta (HNF-1В, поликлональное антитело,GeneTex, США, в разведении 1:200).Исследование выполнялось, используя серийные срезы толщиной 3 мкм,изготовленные из архивных парафиновых блоков, которые были отобраны в ходепредварительного гистологического исследования всех имеющихся образцовткани в каждом наблюдении.
Далее, данные срезы были помещены на покрытыеспециальные предметные стекла для ИГХ исследований (эндогенную пероксидазув депарафинированных срезах блокировали 3% перекисью водорода). Постановкуреакций осуществляли одномоментно для всего материала с целью получениясопоставимых данных, в соответствии с методикой S. R. Shi и соавт. и согласнопротоколам, прилагаемым фирмами-изготовителями к моно- и поликлональнымантителам[147,148].Депарафинированиегистологическихсрезовосуществлялось с использованием ксилола с последующим проведением черезспирты нисходящей крепости до дистиллированной воды по следующемупротоколу, который представлен в таблице 1.Таблица 1Протокол депарафинирования гистологических срезов№ п/пРастворТемператураВремя1.Ксилол IRT*10-15 минут2.Ксилол IIRT5-10 минут3.Ксилол IIIRT2 минуты4.Спирт abs.RT2 минуты5.Спирт 96% IRT2 минуты6.Спирт 96% IIRT2 минуты7.Спирт 70%RT2 минуты8.Спирт 40%RT2 минуты419.ДистиллированнаяRT5 минутвода* RT (room temperature) – комнатная температура (20-22oС).Производилосьвысокотемпературноевосстановлениеантигенныхдетерминант ткани по методам S.
R Shi и соавт. (1997, 2010, 2011) путеминкубации гистологических срезов в буфере (цитратном pH 6, 2 или трис-ЭДТАpH 8, 0 — по рекомендации производителей первичных антител) в PT-модуле длятермической обработки парафиновых срезов (Thermo Scientific, Великобритания)со следующими настройками: температура – 98-99оС, время инкубации – 20±1мин. , предварительный нагрев – 65оС. Остывшие до 85оС препараты на штативахпереносили в аппарат для иммуногистохимического и иммуноцитологическогоокрашивания Autostainer (Thermo Scientific, Великобритания). Постановку ИГХреакций проводили согласно протоколам, прилагаемым фирмами-изготовителямик моно- и поликлональным антителам.Длявизуализацииуниверсальнымивторичнымидиаминобензидином)продуктамиреакцийреакции–применялиантителами,Histophineявлялосьмечеными(NichireiпоявлениеготовуюCorp.,мелкихтест-системухромогеномЯпония).с(3, 3'-Конечнымикоричневатыхгранул(окрашивание коричневого цвета) в участках локализации антигена. Для такихантигенов, как Ki-67, р53, HNF-1βэто – ядра эпителиальных клеток, а для Всl-2 –их цитоплазма.На последнем этапе осуществляли фоновое окрашивание гематоксилиномМайера с последующим промыванием в проточной воде.
Полученные препаратыстандартнымспособомобезвоживаливбатарееспиртоввосходящейконцентрации и ксилола, заключали под покровное стекло с использованиемполистирола.Таким образом, учитывали два негативных контроля (на специфичностьреакции и отсутствие активной эндогенной пероксидазы) и один внутреннийпозитивный (на специфичность реакции).42Гистологические и иммуногистохимические препараты исследовали ифотографировали на микроскопе Axio Imager (Carl Zeiss Microscopy, Германия).2.3.3 Морфометрический методС помощью морфометрического метода изучено 43 наблюдения, из них 35 сэндометриозомяичников (результатыиммуногистохимическойреакциисчетырьмя моно- и поликлональными антителами) и 8 с аденокарциномамияичников (2 случая светлоклеточных, 2 случая высоко дифференцированныхсерозных, 2 случая эндометриоидных и 2 случая муцинозных) с результатамииммуногистохимической реакции с поликлональными антителами к HNF-1β.Для количественной оценки результатов ИГХ реакции использовали методHistochemical score (H-score) [292,293] с учетом количества и интенсивностиокрашенных ядер (Ki-67, p53, HNF-1B) и цитоплазмы (Bcl-2) клеток: до 80 низкая, 80-140 - умеренная, 141-300 - выраженная экспрессия.
Интенсивностьокраски оценивалась по 4-х балльной шкале. Процент окрашенных клеток (или ихядер) представляет собой сумму произведений процентов, отражающих долюклеток (или их ядер) с различной интенсивностью окраски на балл,соответствующий интенсивности реакции. Интенсивность окраски в баллах: 0 –нет окрашивания, 1 – слабое, 2 – умеренное, 3 – сильное окрашивание, 4 – оченьсильное окрашивание.Формула подсчета: H-score = ∑ P(i)•i (или H-score = 1a+2b+3c),где Р(i) – процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью в баллах(i), или а – % слабо, b – % умеренно, с – % сильно окрашенных клеток или ихядер.
Подсчет проводили для 100 эпителиальных клеток в 3-х, случайнымобразом отобранных, полях зрения при увеличении микроскопа х400.2.4 Материалы и методы проспективного исследованияДля проведения проспективного исследования было отобрано 90 пациенток.При отборе пациентов для исследования были сформулированы критериивключения и исключения.43Критерии включения: подтвержденный диагноз эндометриоза яичников поданным патоморфологического исследования и информированное согласиепациента на участие в исследовании.Критерии исключения: проведение оперативного лечения в объеменадвлагалищной ампутации матки у пациенток в позднем репродуктивномпериоде по показаниям и информированный отказ пациента от участия висследовании.Все пациентки с учетом анамнестических, клинических данных, ходапроведенияоперативноголечения,атакжеполученныхрезультатовпатоморфологического исследования были разделены на подгруппы по рискуразвития рецидива эндометриоза.В подгруппу низкого риска вошли пациентки со следующимикритериями (42 пациентки):- возраст пациенток от 33 лет до 45 лет;- отсутствие эндометриоза яичников в анамнезе;-входепроведенияоперативноголечениявыявлено:унилатеральная/билатеральная локализация ЭЯ от 3 см до 6 см, единичныеэндометриоидные гетеротопии других локализаций, спаечный процесс 1 степени;- отсутствие атипии эпителия в очагах эндометриоза яичников по даннымгистологического исследования;- отсутствие экспрессии HNF-1β по результатам ИГХ-метода исследования.В подгруппу среднего риска вошли пациентки со следующимикритериями (32 пациентки):- возраст пациентки от 18 до 32 лет;- отсутствие эндометриоза яичников в анамнезе;- в ходе проведения оперативного лечения выявлено: унилатеральнаялокализация ЭЯ 6 см и более, эндометриоидные гетеротопии других локализаций,спаечный процесс 1-2 степени;- наличие атипии эпителия в очагах эндометриоза яичников по даннымгистологического исследования;44- экспрессия HNF-1β по результатам ИГХ-метода исследования.В подгруппу высокого риска вошли пациентки со следующимикритериями (16 пациенток):- возраст пациентки в диапазоне от 18 до 32 лет;- наличие в анамнезе эндометриоза яичников;- в ходе проведения оперативного лечения выявлено: размер эндометриозаяичников от 6 см и более, билатеральная локализация эндометриоза яичников,эндометриоидные гетеротопии других локализаций, наличие спаечного процессав малом тазу 1-2 степени;- наличие атипии эпителия в очагах эндометриоза яичников по даннымгистологического исследования;- экспрессия HNF-1β по результатам ИГХ-метода исследования.Всем пациенткам с низким, средним и высоким риском развития рецидиваэндометриоза яичников проводился контроль уровня антимюллерова гормона(АМГ) после оперативного лечения с целью оценки овариального резерва.
Вдальнейшем проводилось назначение препаратов из группы аГнРГ в течение 3месяцев (Бусерелин 3,75 мг в/м один раз каждые 4 недели).После окончания терапии проводился контроль уровня онкомаркеров (СА125, СА-19-9, НЕ4) и ТВ-УЗИ с ЦДК.Дальнейшее назначение специализированной терапии с последующейоценкой ее эффективности зависело от принадлежности пациентки к подгруппериска и желания реализации репродуктивной функции.При отсутствии заинтересованности в наступлении беременности (34,4%наблюдений, 31 пациентка) пациенткам со средним и высоким риском развитиярецидива эндометриоза яичников назначались препараты из группы прогестиновв течение 6 месяцев (диеногест 2 мг, перорально, 1 раз в сутки, непрерывно).
Поистечениюданногопериодапроводилсяповторныйконтрольуровнявышеуказанных онкомаркеров и дальнейшее наблюдение.Пациенткам из группы низкого риска, а также пациенткам при желанииреализовать репродуктивную функцию (65,6% наблюдений, 59 пациенток, 26,7%45с рецидивом ЭЯ в анамнезе (из 15 пациенток с рецидивом ЭЯ)) проводилосьнаблюдение без назначения гормональной терапии.2.5 Статистическая обработка результатовСтатистический анализ данных проводился с использованием пакетастатистических программ IBM SPSS Statistics 20.0.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
