Диссертация (1174314), страница 13
Текст из файла (страница 13)
В большинстве случаев трудностьдиагностики образований яичников была связана с наличием сопутствующегоспаечного процесса в малом тазу. Таким образом, информативность двуручноговлагалищно-абдоминальногоисследованияяичниковых образований составила 59,2%.64вдиагностикеэндометриодныхТаблица 11 – Объем и характер проведенных лечебно-диагностическихманипуляций у обследованных пациентокI группаn=109Методы исследованияIАn=78II группаn=64IВn=31IIАn=39IIВn=25Абс.%Абс.%Абс.%Абс.%781003110039100252D УЗИ7810031100391002D УЗИ с ЦДК7810031100397798,73096,87798,7307798,777Двуручное влагалищноабдоминальное исследованиеКомплексное УЗИ органов малоготазаИсследование концентрацииСА-125 в сыворотке кровиИсследование концентрацииСА-19-9 в сыворотке кровиИсследование ЛГ, ФСГ,эстрадиола, прогестерона всыворотке кровиИсследование АМГ в сывороткекровиОперативное лечениелапароскопическим доступомПатоморфологическоеисследованиеВсегоАбс.%10017310025100173100100251001731003692,3249616796,596,83692,3249616796,53096,83692,3249616796,598,73096,83692,3249616796,578100311003910025100173100781003110039100251001731004861,51238,71846,24168247,44861,51238,71846,24168247,44861,51238,71846,24168247,4Исследование экспрессии геновядерных рецепторов эстрадиолаERα, ERβ и прогестерона PRA,PRBмембранных рецепторовэстрадиола mER и прогестеронаPGRMC-1, mPRмаркеров апоптоза bcl-2, p-53 иферментов ЭЦМ MMP-9,TIMP1, TIMP2Ультразвуковое исследование проводилось на аппарате «Voluson 730 Expert»(Kretz-General Electric Medical System, Австрия), с использованием 2,0-7,0 МГцбрюшностеночного датчика и 3,3-10,0 МГЦ мультичастотного внутриполостного.При 2D-эхографии после получения серии продольных и поперечных сечений65проводили последовательный осмотр матки, придатков, пузырноматочного ипрямокишечного пространств.
При этом устанавливались размеры и локализацияобнаруженныхэндометриоидныхобразованийяичников,определялисьособенности формы, внутреннего содержимого и толщины стенки. Интерпретацияхарактера внутреннего содержимого образований основывалась на изученииособенностейзвукопроводимостииналичииполиморфныхакустическихсигналов.При допплерометрии осуществлялся качественный и количественныйанализ кровотока в стенке эндометриоидной кисты и внутриорганного кровотока встромальныхиперифолликулярныхсосудистыхрегионахяичника.Прикачественном анализе оценивалась плотность сосудов и их расположение. Припроведении количественного анализа вычисляли максимальную систолическуюскорость кровотока (Vmax, см/сек), индекс резистентности (ИР).
Подсчетпараметров проводился автоматически в максимально возможном количествесосудов образования, в полученных 3-5 четких кривых скоростей кровотока поодну сторону изолинии. При оценке результатов ориентировались на кривые снаиболее низкими числовыми значениями ИР.После получения данных в сером режиме проводилось исследование сиспользованием энергетического допплера. Исходные параметры допплера былиустановлены на следующих значениях: частота 6-9 МГц (Normal), фильтрпульсации стенок низкий 1(Low1) (40 Гц), частота повторения имульсов 0,6 кГц.Наряду с клиническим обследованием и ультразвуковой диагностикойпациенткамсисследованиемаркеровэндометриоиднымивСА-125сывороткеикровиСА-19-9образованиямиконцентрацииметодомяичниковпроводилосьопухолеассоциированныхиммуноферментногоанализасиспользованием набора фирмы «Hoffman La Roche» (Швейцария). Референсныезначения были следующими: СА-125 – 0-35 Ед/мл, СА-19-9 – 0-37 Ед/мл.Определение онкомаркеров выполнялось на этапе предоперационной подготовки,изучение уровня СА-125 дополнительно проводилось через 6 и 12 месяцев послеоперативного вмешательства.66При изучении гормонального статуса пациенток проводилось исследованиеантимюллерова гормона (АМГ) методом иммуноферментного анализа (DiagnosticSystem Laboratories, Inc.
(DSL), США); фолликулостимулирующего гормона(ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), эстрадиола и прогестерона – методомтвердофазного хемилюминесцентного иммуноанализа (ELISA), с помощьюнаборов «Hoffman La Roche» (Швейцария). Забор сыворотки крови дляопределения содержания ФСГ, ЛГ, эстрадиола осуществлялся на 4-7 деньменструального цикла; для определения АМГ – на 3-5 день цикла. Исследованиепрогестеронапроизводилосьвлютеиновуюфазуменструальногоцикла(нормативные показатели 6,99 – 56,53 нмоль/л).Лапароскопия выполнялась по стандартной методике с использованиемоборудования«KarlStorz»(Германия).Гемостазпринеобходимостиосуществлялся с использованием биполярной и аргоноплазменной коагуляцией.Для БПК использовался электрохирургический генератор Karl Storz Autocon II 350(мощность тока при биполярной коагуляции 35 Вт).
Гемостаз осуществлялсяточечно. Критерием эффективности коагуляции являлась остановка кровотеченияиз ткани яичника. Аргоноплазменная коагуляция проводилась с использованиемаргоноплазменного комплекса «PlasmaJet» (Великобритания).Для гистологического исследования отбирались удаленные по поводуэндометриозафрагментыяичника,которыепослемакроскопическогоисследования и вырезки фиксировались в 10% растворе нейтрального формалина.После гистологической проводки фрагменты заливали в формалин. Срезытолщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.
Гистологическиесрезы стенки эндометриоидного образования, а также прилежащей к образованиюнепреднамеренноудаленнойяичниковойтканиизученыподсветовымбинокулярным микроскопом с цифровой камерой и анализатором изображенийImageScope Color фирмы Leica. Морфометрический анализ проводился спомощью программного обеспечения анализа изображений. Гистологическиепрепараты оценивались по семи морфологическим параметрам: площадь всехфрагментов(мм2),общееколичество67фолликулов(отдельносчиталисьпримордиальные, первичные, вторичные полостные, зрелые и преовуляторныефолликулы), количество фолликулов с дистрофическими изменениями (отдельносчитались примордиальные, первичные, вторичные полостные, зрелые ипреовуляторные фолликулы), толщина всей стенки кисты (в трех точках), толщинаэндометриоза (в трех точках), толщина фиброзного компонента стенки кисты (втрех точках), площадь железистого компонента эндометриоза (мм2).При гистологическом исследовании препаратов биоптатов яичников припомощи морфометрии с использованием анализатора изображения по программеLeica Qwin проводилось измерение толщины удаленной ткани яичника (Тср, мкм),толщины стенки эндометриоидного образования (Еср, мкм) и толщины фиброзаего стенки (Fср, мкм).
Все измерения проводились в 3 различных участкахпрепаратов: измерялась наибольшая и наименьшая толщина ткани, третий участокдля измерения выбирался произвольно. На следующем этапе вычислялась средняявеличина изучаемого параметра.С целью оценки рецепторного статуса эндометриоидной ткани, изученияапоптоза и ремоделирования ЭЦМ в ткани эндометриоидных образованийяичников на базе кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологииим.
Академика П.В.Сергеева РНИМУ им. Пирогова под руководством профессораН.Л. Шимановскогопроводилосьмолекулярно-биологическоеисследованиеэкспрессии генов ядерных рецептов эстрадиола ERα, ERβ и прогестерона PRA,PRB; мембранных рецепторов эстрадиола mER и прогестерона PGRMC-1, mPR;маркеров апоптоза bcl-2, p-53 и ферментов ЭЦМ MMP-9, TIMP1, TIMP2. Тканьэндометриоидногообразованияяичника,полученнуюинтраоперационно,помещали в пробирку типа «эппендорф» с раствором RNA-later (QIAGEN) ихранили при температуре –20°С. Исследование всех полученных образцоввыполнялись одновременно. Выделение мРНК из ткани проводили с помощьюнабора "Рибо-преп" («AmpliSens», Россия) согласно инструкции производителя.Раствор для лизиса прогревали до 650С до полного растворения кристаллов.
Впробирки вносили по 300 мкл раствора для лизиса, затем добавляли 100 мклподготовленных проб, используя наконечники с фильтрами. Содержимое68пробирок тщательно перемешивали с помощью прибора «Вортекс microspin FV2400» (BioSan, Латвия), затем центрифугировали в течение 5 секунд вмикроцентрифуге eppendorf minispin (Eppendorf, Германия). Далее прогревали 5минут при 650С градусах в термостате Гном (ДНК-Технология, Россия),добавляли 400 мкл раствора для преципитации и перемешивали на приборе«Вортекс». Затем центрифугировали 5 минут при 13 тыс.
об./мин. и удалялинадосадочную жидкость. Добавляли в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки3, центрифугировали при 13 тыс. об/мин в течение 2 минут в микроцентрифуге.Затем отбирали надосадочную жидкость, добавляли по 200 мкл раствора дляотмывки 4, снова центрифугировали 2 минуты при 13 тыс. об/мин. Отбиралинадосадочную жидкость и помещали в термостат при температуре 650С на 5 мин,для подсушивания осадка. После испарения жидкости добавляли в эппендорфы по50 мкл РНК-буфера, перемешивали на приборе «Вортекс», затем ставили втермостат при 650С на 5 минут, периодически встряхивая на приборе «Вортекс».Затем центрифугировали эппендорфы при 13 тыс. об./мин. в течение 1 минуты вмикроцентрифуге и собирали надосадочную жидкость, содержащую РНК.Получение кДНК на матрице мРНК проводили с использованием комплектаготовых реагентов "Реверта-L" («AmpliSens», Россия) согласно инструкциипроизводителя.
Приготавливали реакционную смесь: в пробирку с DTTлиофилизированным добавляли 125 мкл RT-mix, затем тщательно перемешивалина приборе «Вортекс». К полученному раствору добавляли 6 мкл ревертазы(MMIv), пипетировали 5 раз, перемешивали на приборе «Вортекс». Далее вносилипо 10 мкл готовой реакционной смеси в пустые эппендорфы, в которые, используянаконечник с барьером, добавляли по 10 мкл РНК-образцов и перемешивали.Пробирки помещали в термостат при температуре 370С на 30 минут, затемполученную кДНК для последующей постановки ПЦР разводили в 2 разаДНК-буфером (к 20 мкл кДНК добавляли 20 мкл ДНК-буфера и пипетировали10 раз).Для полимеразной цепной реакции в реальном времени использовали наборготовых реактивов для ПЦР "Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ в69присутствии SYBR Green I" на приборе iCycler iQ5 real-time PCR.
В качествеконтрольного гена использовался ген Gapdh.Реакционную смесь готовили на 12 реакций: 108 мкл H2Oд+108 мклMIX-смеси, добавили12 мкл MgCl2, перемешивали на приборе «вортекс». Далеедобавлялипо24мклпраймеров(upиlow),сноваперемешивали.Последовательности праймеров представлены в таблице 12.Таблица 12 – Последовательность нуклеотидов в праймерах, используемыхдля ПЦР («Синтол», Россия)генuplowmERagg-gac-aag-ctg-agg-ctg-tagtc-tac-acg-gca-ctg-ctg-aaGapdh:gaa-ggt-gaa-ggt-cgg-agtgaa-gat-ggt-gat-ggg-att-tccERαtgc-caa-gga-gac-tcg-cta-ctctg-gcg-ctt-gtg-ttt-caa-cERβtca-gct-tgt-gac-ctc-tgt-ggtgt-atg-acc-tgc-tgc-tgg-acPRAaaa-tca-ttg-cca-ggt-ttt-cgtac-agc-atc-tgc-cca-ctg-acPRBgac-tga-gct-gaa-ggc-aaa-ggcga-aac-tcc-agg-caa-ggt-gtmPRtgc-cct-gct-gtg-tga-tct-tagat-agc-tga-ggc-tcc-tgg-atPGRmC1tgc-cct-gct-gtg-tga-tct-tagat-agc-tga-ggc-tcc-tgg-atp-53ccc-ttc-aga-ttc-gtg-ggatga-gtt-cca-agg-cct-cat-tcaMMP-9aga-tgt-ggg-tgt-aca-cag-gatta-acc-cgg-ttg-tgg-aaa-ctbcl-2ttt-ctc-ctg-gct-gtc-tct-gaagac-ttc-act-tgt-ggc-cca-gatTIMP1tgc-cct-gct-gtg-tga-tct-tatta-acc-cgg-ttg-tgg-aaa-ctTIMP2gac-tga-gct-gaa-ggc-aaa-ggcga-aac-tcc-agg-caa-ggt-gtГотовую реакционную смесь разливалипо 23 мкл в 200мклэппендорфы.Добавляли по 2 мкл кДНК, тщательно перемешивали и ставили вамплификатор.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
