Диссертация (1174299), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Готовую ПЦР-смесь раскапывалив подготовленные пробирки по 23,7 мкл в каждую. В каждую пробирку добавляли по 1,0 мкл соответствующего образца ДНК. Содержимое пробирокперемешивали и встряхивали на микроцентрифуге. Поверх полученной реакционной смеси наслаивали вазелиновое (минеральное) масло объемом приблизительно 30 мкл. Пробирки закрывали крышками и устанавливали в амплификатор «…» производства компании «…» (Япония).Амплификация проводилась при следующих условиях:• Начальная фаза – при температуре 95°С в течение 15 минут.• 35 циклов амплификации:- плавление ДНК при температуре 95°С в течение 30 секунд;- отжиг праймеров при температуре 55°С в течение 30 секунд;- элонгация при температуре 72°С в течение 20 секунд.• Конечная фаза: при температуре 72°С в течение 2 минут.II этап – с образцом выделенной ДНК параллельно проводили двереакции амплификации – с двумя парами аллель-специфичных праймеров55Результаты анализа позволили дать три типа заключений: нормальнаягомозигота, гетерозигота, мутантная гомозигота.1.
Были приготовлены и пронумерованы пробирки для проведения амплификации вместимостью 0,5 мл (или 0,2 мл) в соответствии с количествоманализируемых проб плюс отрицательный контроль. Для каждой пробы былоприготовлено 2 пробирки (N (норма) и P(патология)).2. За 20-30 минут до приготовления рабочей амплификационной смесиизвлекали комплект реагентов для ПЦР из морозильника «SANYO» (Корея),размораживали содержимое. Пробирки с реакционной смесью и полностьюразмороженным раствором разбавителя тщательно встряхивали для перемешивания содержимого.3.
Из компонентов комплекта были приготовлены рабочие смеси реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу: 17,5 мкл разбавителя, 2,5мкл реакционной смеси, 0,2 мкл Taq-полимеразы.III этап – Определение полиморфизма Т1565С гена GPIIIа (rs5918)Подготовка к проведению реакцииРеактивы поставляются в виде компонентов (реакционная смесь, разбавитель и полимераза), которые необходимо смешать в нужном объеменепосредственно перед проведением исследования.1.
Рассчитывали необходимый объем компонентов, исходя из количества исследуемых образцов плюс четыре (три положительных и один отрицательный контрольный образец) (таблица 2.3).Таблица 2.3 – Пример расчета объема компонентов для определения полиморфизма Т1565С гена GPIIIа (rs5918)№НаименованиеОбъем на реакцию, мкл×3212.5× Реакционная смесь103202Разбавитель103203Taq ДНК-полимераза, 5 Е/мкл0,516562. Размораживали компоненты, перемешивали и центрифугировали.3. Приготовляли смесь компонентов, добавляя их в порядке, указанномв таблице 2.3, перемешивали и центрифугировали.4.
Маркировали ПЦР пробирки/стрипы в соответствии с протоколомисследования.5. Вносили в ПЦР пробирки/стрипы по 20 мкл смеси компонентов.6. В каждую ПЦР пробирку вносили по 5 мкл контрольных и исследуемых образцов в соответствии с маркировкой, перемешивали на встряхивателе и плотно закрывали крышку.7. Кратковременно центрифугировали пробирки/стрипы для сброса капель.8. Помещали пробирки/стрипы в прибор в соответствии с протоколомисследования.Проведение реакции ПЦР-РВ1. В программе «АНК-32» в главном меню выбирали «Циклическийрежим».2. В появившемся окне задавали программу амплификации со следующими параметрами (таблица 2.4):Таблица 2.4 – Пример набора параметров программы амплификации ДНКгена GPIIIаНомерТемператураВремяКоличествоМеткиступени(градусы)(секунды)цикловциклов19512012634040Начало3951540Конец3.
Нажимали кнопку «Сведения об образцах». Вносили в таблицуназвание и тип образцов. Копировали сведения об образцах на все закладки сназванием красителей и нажимали «ОК».574. Нажимали кнопку «Старт».Анализ результатов исследования1. Открывали обрабатываемый файл в программе «АНК-32». Для этоговыбирали «Просмотр», а, затем, нужный файл с расширением .pсr.2. Выбирали первый канал (FAM) для этого в поле «Все каналы» выбирали цифру 1. На открывшемся графике и в открывшемся меню выбиралипоследовательно «Как есть» → «Компенсация» → «Нормировать по фону»→ «Сведения об образцах».
Выставляли пороговую линию, выбрав в том жеменю «Линия ручная». Корректировали положение пороговой линии, принеобходимости.3. Проделывали те же действия для второго канала (R6G).Результат реакции для ПКО1 и ПКО2 должен быть положительным поканал FAM.Результат реакции для ПКО2 и ПКО3 должен быть положительным поканал R6G.Результат реакции для ОКО должен быть отрицательным по канал обоим каналам.В случае получения положительных результатов для ОКО по любомуиз каналов результаты исследования считали недействительными. Требуетсяпредпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации ипровести повторный анализ.Интерпретация результатов осуществлялась нами в соответствие с закономерностью, представленной в таблице 2.5:Таблица 2.5 – Пример интерпретации результатов анализа полиморфизмаТ1565С гена GPIIIа (rs5918)Allele (FAM)аллель ТГенотип Т/ТHeterozygoteаллель Т + аллель СГенотип Т/Саллель СГенотип С/С(FAM+HEX)Allele 2 (HEX)58IV этап – определение полиморфизма G 894Т гена eNOS (rs1799983)Подготовка к проведению реакцииРеактивы поставляются в виде компонентов (реакционная смесь, разбавитель и полимераза), которые необходимо смешать в нужном объеменепосредственно перед проведением исследования.1.
Рассчитывали необходимый объем компонентов, исходя из количества исследуемых образцов плюс четыре (три положительных и один отрицательный контрольный образец) (таблица 2.6).Таблица 2.6 – Пример расчета объема компонентов для определения полиморфизма G 894Т гена eNOS (rs 1799983)№НаименованиеОбъем на реакцию, мкл×3212.5× Реакционная смесь103202Разбавитель103203Taq ДНК-полимераза, 5 Е/мкл0,5162.
Размораживали компоненты, перемешивали и центрифугировали.3. Приготовляли смесь компонентов, добавляя их в порядке, указанномв таблице 2.3, перемешивали и центрифугировали.4. Маркировали ПЦР пробирки/стрипы в соответствии с протоколомисследования.5. Вносили в ПЦР пробирки/стрипы по 20 мкл смеси компонентов.6. В каждую ПЦР пробирку вносили по 5 мкл контрольных и исследуемых образцов в соответствии с маркировкой, перемешивали на встряхивателе и плотно закрывали крышку.7. Кратковременно центрифугировали пробирки/стрипы для сброса капель.8. Помещали пробирки/стрипы в прибор в соответствии с протоколомисследования.59Проведение реакции ПЦР-РВ1. В программе «АНК-32» в главном меню выбирали «Циклическийрежим».2.
В появившемся окне задавали программу амплификации со следующими параметрами (таблица 2.7):Таблица 2.7 – Пример набора параметров программы амплификации ДНКгена eNOSНомерТемператураВремяКоличествоМеткиступени(градусы)(секунды)цикловциклов19512012634040Начало3951540Конец3. Нажимали кнопку «Сведения об образцах». Вносили в таблицуназвание и тип образцов. Копировали сведения об образцах на все закладки сназванием красителей и нажимали «ОК».4. Нажимали кнопку «Старт».Анализ результатов исследования1. Открывали обрабатываемый файл в программе «АНК-32». Для этоговыбирали «Просмотр», а, затем, нужный файл с расширением .pсr.2.
Выбирали первый канал (FAM) для этого в поле «Все каналы» выбирали цифру 1. На открывшемся графике и в открывшемся меню выбиралипоследовательно «Как есть» → «Компенсация» → «Нормировать по фону»→ «Сведения об образцах». Выставляли пороговую линию, выбрав в том жеменю «Линия ручная». Корректировали положение пороговой линии, принеобходимости.3. Проделывали те же действия для второго канала (R6G).Результат реакции для ПКО1 и ПКО2 должен быть положительным поканал FAM.60Результат реакции для ПКО2 и ПКО3 должен быть положительным поканал R6G.Результат реакции для ОКО должен быть отрицательным по канал обоим каналам.В случае получения положительных результатов для ОКО по любомуиз каналов результаты исследования считали недействительными.
Требуетсяпредпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации ипровести повторный анализ.Интерпретация результатов осуществлялась нами в соответствие с закономерностью, представленной в таблице 2.8:Таблица 2.8 – Пример интерпретации результатов анализа полиморфизма G894Т гена eNOS (rs 1799983)Allele (FAM)аллель GГенотип G/GHeterozygoteаллель G + аллель СГенотип G/Таллель ТГенотип Т/Т(FAM+ R6G)Allele 2 (R6G)2.6 Статистический анализ полученных результатовНа заключительном – аналитическом – этапе работы проводили статистическую сводку первичных данных, заносили их в статистические таблицы, формировали электронные балы данных.
На последующем этапе анализа полученных результатов осуществляли расчет средних абсолютных иотносительных величин, коэффициентов, ошибок репрезентативности,среднеквадратических отклонений. В зависимости от используемого метода, объема исследуемых групп, а также математического вида регистрируемого показателя использовали различные методы вариационной статистики,рекомендованные для анализа результатов клинических исследований [176].При сравнении количественных признаков проводили дисперсионныйанализ для оценки нормальности распределения с последующим использо-61ванием критерия t Стьюдента или, в случае сравнения более двух совокупностей, после осуществления одномерного дисперсионного анализа применяли функциональные возможности критериев оценки множественныхсравнений Ньюмена-Кейлса или Даннета.
Достоверность результатов сравнения качественных признаков оценивали с помощью непараметрическоготочного критерия Фишера. При изучении различий признаков до и послевоздействия применяли критерий Уилкоксона при 5% уровне значимости.Для изучения предиктивного потенциала отдельных факторов в формировании исходов ИИ у пациентов – представителей различных этнических групп– использовали метод линейной регрессии, в форме его частного приложения«ROC-анализ». Оценку соответствия наблюдаемого распределения генотиповожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга проводили с использованиемкритерия χ² (хи-квадрат) для выявления отсутствия связи.Статистическую обработку результатов выполняли с помощью компьютерных программ STATISTICA 6,0, SPSS 11,0.62РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙIII.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
