Диссертация (1174297), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Цифрами обозначаетсязначение площади кожи для пациентов старше 2 лет и до 2 лет (в скобках),соответственно. Оценка субъективных ощущений (у детей до 7 лет проводится спомощью родителей) представляет собой совокупное цифровое обозначениевыраженности зуда в дневное и ночное время за предыдущие 3 дня. Оценкаинтенсивности клинических симптомов проводится с помощью четырехуровневой49шкалы: 0 – отсутствие; 1 – слабая; 2 – умеренная; 3 – сильная. Вычисление значенияиндекса SCORAD производится по формуле:Рисунок 5.
Оценка тяжести клинического течения по индексу Scorad.(Федеральные клинические рекомендации по ведению больных атопическимдерматитом. Москва. – 2015.)50SCORAD = А/5+7В/2+С, где:А — площадь распространения кожных поражений;В — суммарное значение показателей интенсивности клинических симптомов;С — суммарное значение показателей субъективных нарушений.Значение SCORAD может находиться в интервале от 0 (отсутствует заболевание)до 103 (максимально степень тяжести течения).2.3 Методы лабораторных исследований.2.3.1 Общеклинические лабораторные исследованияВсем участникам исследования с АД до начала лечения проводился общийанализ периферической крови с определением гемоглобина, эритроцитов,тромбоцитов,эозинофиловосуществлялосьсилейкоцитарныхиспользованиемпоказателей.автоматическогоИсследованиегематологическогоанализатора Sysmex XS-1000i (Япония) методом флуоресцентной проточнойцитометриивцитологическойклиническойлаборатории(заведующаялабораторией – Л.В.
Байдун) РДКБ ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. ПироговаМинздрава России. Исследование общих показателей мочи и биохимическихпоказателейкрови,включающих:общийбелок,мочевину,креатинин,триглицериды, билирубин (общий, прямой, непрямой), АлАТ, АсАТ, глюкозу,щелочную фосфатазу, проводилось с помощью автоматических анализаторов, всоответствии с рекомендациями производителя, в клинико-диагностическойлаборатории (заведующая лабораторией – Е.Г.
Лукьянова) РДКБ ФГБОУ ВОРНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.Определение общего IgE, осуществлялось методом иммунонефелометрии спомощью автоматического анализатора специфических белков IMMAGE 800(Beckman Coulter, США) в лаборатории клинической иммунологии (заведующаялабораторией – Л.А. Грачева) РДКБ ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. ПироговаМинздрава России.
Для определения пределов нормальных значений применялисьреферентные величины, указанные производителями наборов диагностическихреактивов.512.3.2 Бактериологическое исследованиеУ всех участников исследования с АД в первые 48 часов после поступленияв стационар, после физикального осмотра и оценки тяжести состояния, проводилсязабор биоматериала из передних отделов носовых ходов и с поверхностипораженной кожи. Участникам, не имеющим заболеваний кожи и ЛОР-органов,забор биоматериала осуществлялся в поликлиническом отделении, во времяплановогопосещения.Взятие,транспортировкаибактериологическоеисследование полученного материала проводилось в соответствии с приказом №535 Минздрава СССР от 22.04.1985 «Об унификации микробиологических(бактериологических)диагностическихметодовлабораторияхисследования,применяемыхлечебно-профилактическихвклинико-учреждений»иметодических указаний 4.2.2039-05 «Методы контроля.
Биологические имикробиологические факторы. Техника сбора и транспортирования биоматериаловв микробиологические лаборатории».Сбор биоматериала с пораженной кожи выполнялся вращательнымидвижениями от центра к периферии с помощью сухого стерильного вискозноготупфера «Transwab» (Medical Wire, England). После взятия материала тампонпомещался в стерильную пластиковую пробирку с транспортной средой Эймса,которая обеспечивает сохранение жизнеспособности аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов, присутствующих в биоматериале, на этапетранспортировки образца до лаборатории клинической бактериологии.При взятии мазка со слизистых передних отделов носовых ходов стерильныйвискозный тампон вводился в носовой ход до упора на уровне носовой раковины.Сбор биоматериала проводился вращательными движениями, в каждом носовомходу.
Затем, тампон с биоматериало помещался в стерильную пластиковуюпробирку «Transwab» с транспортной средой Эймса (Medical Wire, England). Обаобразца в течение часа доставлялись в лабораторию клинической бактериологии(заведующая лабораторией – к.м.н., ассистент Федорова Н.И.) РДКБ ФГБОУ ВОРНИМУ им. Н.И. Пирогова. Посев биоматериала проводился на твердыепитательные среды: кровяной агар (BD, США), шоколадный агар (BD, США),52МакКонки агар (BD, США), манит-Солевой агар (BD, США), хромогенный агар«Uriselect» (Bio-Rad, Франция), Сабуро агар с хлорамфениколом (bioMerieux,Франция).Посев выполнялся методом «тампон-петля»: тампоном проводилась«дорожка» по диаметру чашки Петри, затем другой стороной тампона засеваласьеще одна «дорожка», параллельная первой.
После этого материал рассевался почашке при помощи петли штрихами, перпендикулярными «дорожкам». Чашкиинкубировались при температуре 35ºС в течение 5 суток. Инкубация чашек скровяным и шоколадным агарами осуществлялась при той же температуре ватмосфере 5-10% СО2. Ответ об отсутствии роста выдавался на 5 сутки. Получениечистой культуры проводили методом рассева по Гольду или методом истощающегоштриха. (Рис. 6)Рисунок 6. Посев культуры S.
aureus на питательные среды.Количественная оценка результатов, в соответствии с Приказом №535 от22.04.1985 МЗ СССР, проводилась по критериям интенсивности роста на плотнойпитательной среде: скудный (0-10 колоний), умеренный (10-100 колоний),обильный(>100колоний).Видоваяидентификациямикроорганизмовосуществлялась методом масс-спектрометрии на анализаторе «Vitek MS»(bioMerieux, Франция). Определение чувствительности к антибактериальнымпрепаратам проводилось на автоматическом микробиологическом анализаторе53«Phoenix» (BD, США) методом серийных разведений с определением минимальнойингибирующей концентрации антибиотика. Определение чувствительности ирезистентности микроорганизмов к антимикробным препаратам проводилось всоответствии с актуальными клиническими рекомендациями ЕвропейскогоКомитетаТестированияАнтимикробнойЧувствительности(EUCAST)от01.01.2018 (http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/).Контроль качества осуществлялся с применением контрольных штаммовStaphylococcus aureus АТСС 25923, Esherichia coli АТСС 25922, Enterococcusfaecalis АТСС 29212.2.3.3 Молекулярно-генетические исследованияБыло проведено исследование 180 клинических изолятов S.
aureus,выделенных от 60 пациентов с АД отделения дерматовенерологии и 30 посетителейполиклинического отделения «Российской Детской Клинической Больницы», неимеющих заболеваний кожи и ЛОР-органов. Выделение ДНК проводили из 1,5 млночной культуры S. aureus, выращенной в Brain-Heart бульоне, которую осаждалицентрифугированием, после чего отмывали в 500 мкл ТЕ буфера (pH 8,0). Послеосаждения микробных клеток буфер сливали, оставляли в пробирке 50 мкл идобавляли 100 мкл 6 М раствора гуанидина тиоционата. Затем проводилась 20минутная инкубация пробирок в ультратермостате при 65ºС. Во время инкубациипробирки регулярно встряхивались на Вортексе с интервалом в 3 минуты.
Послеинкубации добавляли 20 мкл сорбента (SiO2) и продолжали инкубировать наультратермостате в течение 10 минут, регулярно встряхивая пробирки на Вортексе.Очистка полученной ДНК проводилась двукратно с использованием 70ºСэтилового спирта. Остатки этанола удалялись с помощью центрифугирования.Полученный раствор ДНК хранили в замороженном состоянии при температуре 20ºС [6].
Наличие расположенных на бактериофагах генов, детерминирующихсинтез SEA и энтеротоксин-подобного SEP, а также присутствующих в составеострововпатогенностиразличныхтиповгенов,кодирующихсинтезэнтеротоксинов: SEB, SEC, SEG и токсина синдрома токсического шока (TSST-1)54определяли методом ПЦР с использованием праймеров [90]. Наличие генов sed иsee тестировали согласно методике [69]. Наличие генов лейкоцидина LukDE игенов комплекса иммунного уклонения (CHIPS, SCIN, SAK) определялосьсогласно методике [5]. ПЦР-амплификацию осуществляли в объеме 25 мкл сиспользованием 0,4 мкл Tag-полимеразы (Силекс-М, Россия). Реакционная смесьсостояла из реакционного буфера (2,5 мкл, pH=8,6), MgCl2 (2,5 мМ), а также 2,5мМоль дезоксинуклеотидтрифосфата (Силекс-М, Россия). Праймеры былисинтезированы фирмой «Евроген» (Россия). (Табл.
2)Таблица 2.Праймеры, использованные в молекулярно-генетических исследованияхГенseasebsecsedseesegseptstПраймерНуклеотидная последовательностьРазмер(5’- 3’)фрагментаNsea-Fgaa aaa agt ctg aat tgc agg gaa caNsea-Rcaa ata aat cgt aat taa ccg aag gtt cNseb-Fatt cta tta agg aca cta agt tag ggaNseb-Ratc ccg ttt cat aag gcg aacNsec-Fctt gta tgt atg gag gaa taa caa aac atgNsec-2Rcat atc ata cca aaa ag tatt gcc gtNsed-Fgaa tta agt agt acc gcg cta aat aat atgNsed-Rgct gta ttt ctc cga gag tNsee-Fcaa aga aat gct tta agc aat ctt agg cNsee-Rcac ctt acc gcc aaa gct gGseg-Ftct cca cct gtt gaa ggGseg-Raag tga ttg tct att gtc gGsep-Fgaa ttg cag gga act gctGsep-Rggc ggt gtc ttt tga acNtst-Fttc act att tgt aaa agt gtc aga ccc actNtst-Rtac taa tga att ttt tta tcg taa gcc ctt56040427549248232318218055chpscnsaklukDENchp-Faac cgt ttc cta caa atg aagNchp-Rtta cat aag atg att tag actNscn-Ftgt tta aac ttc cag tag ctaNscn-Raat cta tac ttg cgg gaa ctt tag cNsak-Facc ttt gta att taa agt tga atc cagNsak-Rcta tta aac ctg gga cta cac tta cNlukDE-Fgcc ata aga ata acct aa tgtNlukDE-Rtaa tcc atc gtt tat cac tac318192250662В зависимости от пары праймеров, их концентрация подбираласьэмпирическим путем и составляла от 15 до 50 пкм.
Амплификация выполнялась натермоциклире «Терцик» (ДНК-технология, Россия). В процессе амплификациипроводилась предварительная 2-х минутная денатурация при 94º, с последующими30 циклами амплификации, включающих 30 секундную денатурацию при 94ºС, 1минуту отжига при 50ºС и 2 минуты удлинения при 72ºС. Визуализацию продуктовамплификации осуществляли с помощью гель-электрофореза в трис-ацетатномбуфере с использованием 2,75% агарозы (Promega, США) и этидиум бромида.Размер ампликонов определяли, используя ДНК-руллер фирмы «Fermentas». Вкачестве положительных контролей использовали ДНК из референтных штаммовS. aureus NCTC 8511 (sea, seb), NCTC 9315 (tst), NCTC 8331 (sec, tst), FRI1151m(sed), FRI913 (see), N315 (sep).Результаты молекулярно-генетического исследования изолятов на предметобнаружения генов кластера иммунного уклонения были сгруппированы в 7типов, описанных в исследовании Van Wamel W.J.B.
и соавторов [176].2.4 Комбинированная коррекция стафилококковой инфекции.На основании проведенного бактериологического обследования, участникиисследования с АД методом случайных чисел (четные – группа сраавнения,нечетные – основная группа) были разделены на две группы, численностью 30(N=30) детей в каждой. В третью группу (N=30) были включены амбулаторные56посетители поликлинического отделения с неотягощенным дерматологическиманамнезом.Участники обеих групп исследования получали системную терапию АД.Лечение было направлено на устранение и предупреждение взаимодействия спровоцирующими/триггернымифакторами,способствующимиобострениювоспалительного процесса.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
