Диссертация (1174280), страница 9
Текст из файла (страница 9)
В промаркированныепробирки внесли по 25 мкл. аликвот сывороток, положительный иотрицательный контроли. В пробирки для исследования общего связывания48добавили50125мкл.неспецифическогоI–Tracerсвязывания(T),вдобавитьпробиркидля50125мкл.исследованияI–Tracer(NSB),перемешали и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре,после чего измерили радиоактивность. Далее добавили 125 мкл.
анти-IgGантитела в каждую пробирку, перемешали и инкубировали в течение 1 часапри комнатной температуре. По истечении инкубации добавили 1 мл.промывного раствора, перемешали и центрифугировали пробирки в течение10 минут при 4000 об/мин. Удалили надосадочную жидкость и повторилипроцедуру отмывания осадка. Подсчитали радиоактивность в гамма-счетчикеполученного осадка в течение 2 минут.
Концентрацию антител к ПЗКК P/Qтипа вычисляли по формуле, приведенной в инструкции производителя, сиспользованием фактора, учитывающего дату изготовления набора иудельнуюактивностьметки,радиоактивностьпробприобщеминеспецифическом связывании антител, а также радиоактивность негативногоконтроля. Повышенным уровнем антител к ПЗКК являлось значение,превышающее 20 Пмоль/л.С помощью коммерческой тест-системы «ACHRAB Assay RIA(Acetylcholine Receptor Antibody)» («DLD Diagnostika GMBH», Германия)определяли концентрацию антител к АХР радиоиммунологическим методом.Пробоподготовку и проведение исследования выполняли в соответствии синструкцией производителя. Образцы сывороток крови хранили при -200С.Раствор рецептора125I-рецептора ацетилхолина готовили за 30 минут доначала проведения исследования.
Непосредственно перед проведениеманализа сыворотки размораживали при комнатной температуре, отбиралиаликвоты по 5 мкл и помещали в промаркированные пробирки, всоответствующие пробирки вносили по 5 мкл. стандартов и положительныйконтроль. Во все пробирки добавляли 100 мкл125I-рецептора ацетилхолина,перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 2часов, по окончанию инкубации подсчитывали радиоактивность проб.
Вкаждую пробирку вносили по 50 мкл антител к IgG человека, перемешивают49и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Далеедобавлялипо1млпромывочногобуфера,перемешивалиицентрифугировали в течение 20 минут при 3000 об/мин., удалялинадосадочную жидкость. Повторяли процедуру отмывки осадка. Послеполучения осадка измеряли радиоактивность проб в гамма-счетчике втечение 1 минуты.
В соответствии со значениями стандартов вычисляликонцентрацию антител к АХР исследуемых образцах.Повышеннойконцентрацией антител к АХР считали значение, превышающее 0,50Нмоль/л.С помощью тест-системы «Titin Antibody ELISA» («DLD DiagnostikaGMBH», Германия) в сыворотках исследуемых пациентов определялиуровень антител к титину. Данный набор основан на иммуноферментноманализе, с фиксированным на твердой фазе рекомбинантным белком титина(MGT 30). Пробоподготовка и выполнение исследования проводили всоответствии с инструкцией производителя. Исследуемые сыворотки кровизамораживали однократно при температуре -200С до проведения анализа.Непосредственно перед началом исследования, сыворотки размораживалипри комнатной температуре, перемешивали и разводили в соотношении 1:101сразводящимраствором.Промывающийрастворразводилидистиллированной водой до конечного объема 500 мл.
Калибраторы,положительный и негативный контроли, а также разведенные исследуемыеобразцы вносили по 100 мкл. в соответствующие лунки и инкубировали втечение 60 минут при комнатной температуре в горизонтальном шейкере. Поокончании инкубации удаляли жидкость и промывали лунки буфером (300мкл.), процедуру повторяли 3 раза. Далее удаляли промывной буфер, вкаждую лунку планшета вносили 100 мкл. коньюгата (меченные ферментомвторичнымиантителамипротивинкубировали в течение 30иммуноглобулиновчеловека)иминут при комнатной температуре вгоризонтальном шейкере. Повторяли процедуру отмывки и, после удаленияжидкости, вносили по 100 мкл субстрата в каждую лунку, инкубировали в50течение 15 минут при комнатной температуре в горизонтальном шейкере.Далее останавливали реакцию, внесением 100 мкл.
соответствующего буферав каждую лунку и в течение 10 минут после окончания процедуры считывалиоптическую плотность при длине волны 450 нм с использованиемсчитывающего устройства Mini-reader (DYNATECH). Уровень антител ктитину рассчитывали как отношение оптической плотности тестируемойсыворотки к оптической плотности калибратора и обозначали как индекс«К», единицы измерения – условная единица (У.Е.). Согласно инструкциипроизводителя, значение «К» более 1.0 У.Е. считали выше нормы.2.6.Статистическая обработка материалаСтатистическая обработка данных выполнена на индивидуальномкомпьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel», и пакетаприкладных программ "SPSS for Windows".
v.17.0 и Statistica v.10.0.Всеполученныеколичественныеданныеобработаныметодомвариационной статистики. Для каждого количественного параметра былиопределены: среднее значение (M), среднеквадратическое отклонение (SD),ошибка среднего (m), медиана (Me), интерквартильный размах (Q1-Q3), 95%доверительный интервал. Для качественных данных определяли показателичастоты (%).Перед проведением сравнительного анализа количественных данных висследуемыхгруппахопределяливидраспределенияданных(тестКолмогорова-Смирнова, графический анализ данных). При нормальном видераспределения данных для оценки различий в группах применялись методыпараметрической статистики (t-критерий Стьюдента). При отсутствиинормального распределения данных применялись методы непараметрическойстатистики – U-тест Манна-Уитни.При оценке качественных признаков использовался критерий χ2Пирсона.
В случаееслиабсолютные частотыв клеткахтаблицы51сопряженностибылименее10,использовалипоправкуЙетсананепрерывность.Статистически значимыми считались отличия при p<0,05 (95%-йуровень значимости) и при p<0,01 (99%-й уровень значимости).Связь между изучаемыми показателями оценивалась по результатамкорреляционногоанализасвычислениемкоэффициентакорреляцииСпирмена (r) и последующим установлением его значимости по критерию t.Тексты всех использованных в нашей работе шкал и опросниковприведены в Приложении.52ГЛАВА 3.
РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯПАЦИЕНТОВ С МСЛИ И МИАСТЕНИЕЙБыло обследовано 40 больных с МСЛИ (19 мужчин и 21 женщин) ввозрасте от 18 до 66 (47,2±14,7) лет. У 12 пациентов (9 мужчин и 3 женщины)было диагностировано онкологическое заболевания, у остальных 28 больныхв ходе наблюдения и периодического обследования в течение более 2-х летпризнаков онкологического заболевания выявлено не было.Соотношение мужчин и женщин в изученной группе больныхсоставило – 1; 1,1.Также было проведено обследование 40 пациентов с миастенией (15мужчин и 25 женщин) в возрасте от 18 до 79 лет (38,1±19,7). У 7 больных (2мужчин и 5 женщин) была выявлена опухоль вилочковой железы - тимома.Соотношение мужчин и женщин в группе больных с миастениейсоставило – 1; 1,6.В целом, все пациенты могли точно указать возраст дебюта и первыепроявления заболевания с последующим постепенным прогрессированиемпатологии.Сопоставление частоты выявления МСЛИ и миастении с возрастомначала заболевания больных представлено на рисунке 3:5316141210МСЛИ8Миастения6420до 30 лет31-40 лет41-50 лет51-60 летстарше 61летРисунок 3 – Сопоставление частоты выявления МСЛИ и миастении с возрастом дебютазаболевания.По оси абсцисс - возрастные группы дебюта заболевания.По оси ординат – количество пациентов в каждой возрастной группе.Как следует из представленных на рисунке 3 данных, в группепациентов с МСЛИ у 15 (37%) больных манифестация заболевания была ввозрасте от 51 до 60 лет, у 9 (22%) – в возрасте до 30 лет, у 6 (15%) – возрастеот 31 до 40 лет, у 6 (15%) – в возрасте от 41 до 50 лет и у 4 (10%) пациентовначало заболевания приходилось на возраст старше 60 лет.
В группе больныхс миастенией у 16 (59%) пациентов дебют заболевания был в возрасте до 30лет, у 3 (11%) – в возрасте до от 31 до 40 лет, у 2 (7%) – возрасте от 41 до 50лет, у 1 (3%) – в возрасте от 41 до 50 лет и у 5 (18%) пациентов началозаболевания приходилось на возраст старше 60 лет.Результатыизучениячастотысопутствующейаутоиммуннойпатологии у больных с МСЛИ и миастенией представлены в таблице 1.54Таблица 1. Частота сопутствующей аутоиммунной патологии у пациентовМСЛИ и миастенией.наличие сопутствующейМСЛИмиастениейр11 (27%)9 (22,5%)0,625аутоиммунной патологиипациентов, n (%)Согласно представленным в таблице 1 данным сопутствующаяаутоиммунная патология отмечалась у 11 пациентов с МСЛИ (27%),витилиго3,аутоиммунныйтиреоидит5,ревматоидныйартрит1,неспецифический язвенный колит 1, системная красная волчанка 1.
В группебольных с миастенией сопутствующая аутоиммунная патология встречаласьу 9 пациентов (22,5%), аутоиммунный тиреоидит 5, ревматоидный артрит 2,сахарный диабет 1 типа 1, неспецифический язвенный колит 1, псориаз 1.Анализ представленных в таблице 1 данных показал, что частотасопутствующейаутоиммуннойпатологиивгруппахисследованиядостоверно не различалась.Анализ распространенности курения у пациентов с МСЛИ имиастенией представлен в таблице 2.Таблица 2. Распространенность индекса курения более 20 пачек/лет убольных с МСЛИ и миастенией.частота индекса курения более 20МСЛИмиастенияР15 (37%)9 (22,5%)0,186пачек/лет, n (%)Как следует из представленных в таблице 2 данных, частота курения упациентов с МСЛИ статистически достоверно не отличалась от частотыкурения у пациентов с миастенией.55Пациенты с МСЛИ, в числе первых проявлений заболевания,указывали на возникновение слабости в проксимальных мышцах нижнихконечностей (95%) и наличие нарушений походки (60%), проявлявшейсяощущением скованности в конечностях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
