Диссертация (1174231), страница 11
Текст из файла (страница 11)
е. 1 мл раствора. Необходимый объём раствора рассчитывался исходя из массы животного.Для приготовления раствора использовался порошок дигидрата аскорбата лития.Молекулярная масса безводного аскорбата лития — 178 г/моль, дигидрата аскорбата лития — 214 г/моль. В дигидрате аскорбата лития литий и аскорбатанион представлены в молярном соотношении 1 : 1, а в массовом соотношении1 : 71,33. Таким образом, 250 мкг элементного лития содержится в 250 × 71,33 =17,84 мг дигидрата аскорбата лития. Аскорбат лития производства ООО «Нормофарм» (Россия).2.1.3. Протокол экспериментального исследованияВся работа с животными выполнялась на базе НИЦ ФГБОУ ВО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздрава России.
Проводилосьзондирование животных раствором органических солей лития в дозе 1 мг/кг(в расчете на элементный литий). Выбор данной дозы обусловлен тем, что эффекты органических форм лития достоверны уже при дозах в 30–100 мкг/кг (приприёме в течение 1–3 месяцев) (Гоголева И. В., 2009). Для исследования фармакокинетики и распределения лития в тканях было решено использовать однократное введение десятикратной дозы от 100 мкг/кг, т. е. 1 мг/кг. Так как LD50аскорбата лития составляет 6 334 мг/кг, LD50 цитрата лития составил 1516,7 мг/кг,то доза в 1 мг/кг элементного лития в 1000 раз меньше среднелетальной дозы.В I подгруппе через 45 мин после введения аскорбата лития производиласьдекапитация с последующим отбором органов и биологических жидкостей,60во II подгруппе эксперимент проводился через 1 ч после введения соли лития, вIII — через 1,5 ч, в IV — через 3 ч, в V — через 6 ч, в VI — через 12 ч, в VII —через 24 ч, в VIII — через 48 ч, IX подгруппа аскорбат лития не получала, производился забой лабораторных животных с последующим отбором органов и биологических жидкостей (рис.
9).Рисунок 9 — Протокол экспериментального исследованияпри введении аскорбата лития per os в дозе 1 мг/кгВ X группе через 45 мин после введения цитрата лития производилась декапитация с последующим отбором органов и биологических жидкостей,в XI подгруппе эксперимент проводился через 1 ч после введения соли лития,в XII — через 1,5 ч, в XIII — через 3 ч, в XIV — через 6 ч, в XV — через 12 ч,в XVI — через 24 ч, в XVII — через 48 ч, XIX подгруппа цитрат лития не получала, производился забой лабораторных животных с последующим отбороморганов и биологических жидкостей.
Методом масс-спектрометрии определялсяуровень лития в 11 различных биосубстратах: цельная кровь, головной мозг,лобная доля головного мозга, сердце, аорта, лёгкие, печень, почки, селезёнка,надпочечники, бедренная кость, моча (рис. 10).61Рисунок 10 — Протокол экспериментального исследованияпри введении цитрата лития per os в дозе 1 мг/кг2.1.4. Методы определения уровня лития в биосубстратахДля определения уровня лития были получены гомогенаты тканей исследованных биосубстратов. Образцы гомогенатов отбирались в пластиковые пробирки и разбавлялись в 5 раз бидистиллированной и деионизированной водой.При проведении масс-спектрометрии в качестве внутреннего стандарта в растворы вводили индий в концентрации 25 мкг/л.
Калибровочные растворы были приготовлены из стандартных растворов фирмы VTRC с известным содержанием вдиапазоне от 5–1000 мгк/л (10–7%). Полученные растворы анализировались намасс-спектрометре с ионизацией в индуктивносвязанной плазме Plasma QuadPQ2 Turbo (VG Elemental, Англия). Рабочая мощность СВЧ генератора была 1,3кВт. Расход плазмообразующего газа (аргон) — 14 л/мин, транспортирующегогаза — 0,89 мл/мин. Проводилось от 3 до 10 экспозиций каждого образца, времяинтегрирования сигнала составило 60 с.622.1.5. Фармакокинетический анализ параметров биораспределенияДля настоящего исследования был использован метод фармакокинетического анализа с использованием электронных таблиц Excel, дополненного модулями программного пакета PKSolver (Ferreira A.
J. M., 2009).2.2. Моделирование нейродегенеративного повреждениянейронов головного мозга крыс2.2.1. Объект исследованияВ работе использовались 7–8-суточные культуры, полученные методомферментно-механической диссоциации клеток мозжечка семидневных крыс поранее описанной методике (Стельмашук Е. В., 2010).
В исследовании было использовано свыше 2500 культур.2.2.2. Получение диссоциированных монослойных культурВся работа с животными и культурами выполнялась на базе федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования«Ивановская государственная медицинская академия» Минздрава России.Крысы получали летальную дозу эфирного наркоза, после чего 5 мин стерилизовались 70%-ным спиртом.
Далее у животного быстро вскрывали череп,извлекали мозжечок и переносили его в пластиковую чашку Петри, заполненнуюфосфатным буфером, лишённым ионов кальция и магния. Фрагменты ткани инкубировали 15 мин при +37°С в фосфатном буфере, содержащем 0,05% трипси-63на, 0,02% этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,8% глюкозы. После инкубации ткань промывали в двух сменах фосфатного буфера и один раз средой культивирования, далее подвергали механической диссоциации в питательной средедля культивирования.
В состав питательной среды входили 90% минимальнойсреды «Игла», 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 5 мМкалия хлорида и 10 мМ буфера Нереs, pH 7,2–7,4. Суспензию клеток центрифугировали в течение 1 мин при 1 000 об/мин, супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в питательной среде. Культивирование производили в 96-луночных пластиковых планшетах, покрытых полиэтиленимином или полилизином, в питательной среде, где уровень хлорида калия доведён до 25 мМ. В каждую ячейку планшета добавляли по 0,1 мл суспензии клеток.
Культивированиепроизводили 7–8 суток в СО2-инкубаторе, заполненном газовой смесью (95%воздуха + 5% СО2), при температуре +35,5°С и относительной влажности 98%.К этому сроку культивированные зернистые нейроны (КЗН) достигали своейморфологической и нейрохимической зрелости (рис. 11).Рисунок 11 — Методика получения диссоциированных монослойных культур64По окончании экспериментов культуры зернистых нейронов мозжечкафиксировали 5 мин смесью спирта, формалина и ледяной уксусной кислотыв отношении 7 : 2 : 1 соответственно и окрашивали 2–5%-ным трипановым синим или ванадиевым гематоксилином, приготовленным непосредственно передокрашиванием и содержащим 98 мл дистиллированной воды, 1 мл 10%-ногозапасного раствора гематоксилина в этиловом спирте, 1 мл 0,5%-ного раствораметаванадата аммония и 1–2 капли ледяной уксусной кислоты.
Фиксированныеи промытые дистиллированной водой культуры окрашивали в растворе ванадиевого гематоксилина 15 мин, в результате чего клетки приобретали синий или сине-фиолетовый цвет. Окрашенные культуры промывали, обезвоживали в спиртахвосходящих концентраций, ксилоле и заключали в канадский бальзам илизаливали глицерином сразу после промывки водой, если культивирование проводилось в пластиковых камерах.Состояние культур контролировали ежедневно и на каждом этапеэксперимента путем визуального просмотра в инвертированном микроскопепри фазовом контрасте (Aghdam S.
Y., 2007). Ферментно-механическую диссоциацию ткани проводили по опубликованной методике (Андреева Н. А.,2000).2.2.3. Приготовление растворов солей литияРастворы солей лития приготовлялись из сухих безводных солей. Неорганические соли лития (Lithium carbonate Li2CO3, 1.05671.1000, сертификатыPh Eur, BP, USP; Lithium chloride LiCl, 1.05679.0100, сертификаты Reag. Ph Eur)были производства фирмы «Merck» (Германия). Аскорбат лития производстваООО «Нормофарм» (Россия).
Цитрат лития производства «DSM NutritionalProducts AG» (Швейцария). Цитрат натрия был синтезирован в ФГБОУ ВО ИвГМА Минздрава России.652.2.4. Программа экспериментальных исследованийИсследование эффектов каждой соли лития проводили в 2 этапа: 1-й эксперимент, в котором изучалось воздействие различных концентраций солей лития(LiCl, Li2CO3, LiС6Н7О6, Li3C6H5O7) и натрия (Na3C6H5O7, NaC6H7O6) на выживаемость КЗН без добавления глутамата, и 2-й эксперимент, в котором КЗН культивировались при различных концентрациях растворов солей лития и натрия в течение5 суток, на 6-е сутки добавляли в культуру глутамат в концентрации 100 мкМ,затем регистрировали выживаемость КЗН в условиях глутаматного стресса.В первом эксперименте сухие соли лития и натрия растворяли в деионизованной воде в концентрации 10 мМ, затем стерилизовали ультрафильтрацией идобавляли в среду культивирования на 2-е сутки in vitro на весь срок культивирования (до 7 суток).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
