Диссертация (1174225), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Присутствие молекул и макромолекул, способных превращать активные радикалы в неактивные частицы (например, антиоксиданты, разрушающие цепь), составляет одну из этих защитных мер. Этот тип защиты включаетмножество соединений, несущих различные реакционные центры (например, фенолы, тиолы) с сильно различающимися гидрофобными свойствами.
В связи сэтим существует большой интерес к определению «суммарной» антиоксидантной(или захвата свободных радикалов) емкости биологических жидкостей, посколькуона может определять способность системы противостоять окислительномустрессу. Кроме того, пониженные значения могут быть связаны с патологиями,которые определяются повышенными количествами (или установившимися концентрациями) свободных радикалов.Один из наиболее часто используемых методов для оценки антиоксидантного статуса биологической жидкости - это метод полного потенциала захвата радикалов (TRAP), разработанный Wayner et al. [365].
Он основан на измерениивремени индукции при окислении липидной дисперсии под воздействием источника свободных радикалов с постоянной скоростью образования свободных радикалов в аэробных условиях. АБАП используется в качестве источника свободныхрадикалов, уменьшение концентрации кислорода используется для измеренияскорости окисления. Эта процедура была изменена путем использования другихрадикальных источников и / или других методов для контроля скорости процесса.Другой параметр измеряет общую реакционную способность антиоксиданта(TAR) и определяется как сумма всех антиоксидантов, присутствующих в образ-89це.
Этот параметр может представлять собой полезный показатель способностиданного соединения (или жидкости) модулировать ущерб, связанный с повышенным образованием свободных радикалов. Таким образом, TRAP отображает количество антиоксиданта в системе, а TAR – его активность, т.е. скорость взаимодействия антиоксиданта с радикалами [243].Более простой и воспроизводимой является методика определения антиоксидантной активности методом активированной хемилюминесценции в системена основе АБАП и люминола в буферном растворе при рН 7.4 (рН плазмы крови внорме) [69].2.2.
Дизайн исследования. Пациенты и методы исследованияВ исследование было включено 97 пациенток с верифицированной причиной бесплодия, которым было проведено хирургическое лечение по поводу бесплодия. Исследование проводилось в 2 этапа. Дизайн исследования приведен втабл. 2.1.На первом этапе был исследован системный и локальный окислительныйстресс у пациенток с НГЭ, ТПБ и СПКЯ методом активированной хемилюминесценции в плазме крови и перитонеальной жидкости. Известно, что свободные радикалы атакуют молекулу, вследствие чего происходит их переход в возбужденное состояние, дальнейшее их возвращение в основное состояние сопровождаетсявысвобождением фотона, которые и улавливаются хемилюминометром (реакция1).
Интенсивность свечения зависит от скорости образования свободных радикалов [19].РадикалыПродукт*Продукт + фотон (реакция1)Однако собственное свечение очень ничтожно, с связи с этим используютсяактиваторы хемилюминесценции, такие как люцигенин, люминол, кумарин. Приих добавлении интенсивность хемилюминесценции возрастает (реакция 2).Продукт* + активаторПродукт + активатор*фотон 2 (раекция2)90Табл. 2.1 Дизайн исследованияЭтапЗадача исследоваработыния1 этапОпределение(проспективный) уровня системногои локального антиоксидантногопрофиля у пациенток с НГЭ2 этапПрооксидантные(проспективный) свойства содержимого эндометриодной кистыАнтиоксидантныйпрофиль тканияичника, содержащего эндометриодную кистуПЖ- перитонеальная жидкостьИсследуемыеобразцыПлазма и ПЖпациенток сНГЭПлазма и ПЖпациенток сТПБПлазма и ПЖпациенток сСПКЯСодержимое эндометриоднойкистыСтенка кистыТкань яичника,прилежащего кэндометриоднойкистеТкань здоровогояичника (контрольная группа)КоличествоВсегообразцов пациенток36561191238383810Забор крови осуществлялся до проведения любых хирургических вмешательств.
Перитонеальную жидкость аспирировали из дугласова пространства вовремя лапароскопии сразу после введения дополнительных контрапертур до проведения хирургических манипуляций. Образцы центрифугировали для освобождения от клеточной фракции, затем хранили при температуре –20°C до аналитического этапа, размораживание образцов проводили при комнатной температуре.В забранных образцах оценивали антиоксидантный профиль по методике, разработанной Е.В. Проскурниной [69].Регистрацию антиоксидантного профиля имевшихся образцов плазмы и перитонеальной жидкости проводили на одноканальных хемилюминометрах Lum5773 («ДИСофт», Россия, серийные № 1С000035, 1С000036, 4500408) при температуре 37°С.
В качестве среды использовали фосфатный буферный (ФБ) раствор –91100 мМ раствор KH2PO4, pH ФБ – 7,4, температура – 37°С. В качестве генераторасвободных радикалов использовали AБАП. Рабочий раствор 0,05 М готовили вмикропробирке растворением навески 0,0135 г в 1 мл ФБ. В качестве усилителяхемилюминесценции использовали люминол. Для приготовления рабочего раствора 0,1 мМ смешивали 50 мкл исходного раствора (1мМ) и 450 мкл ФБ.
50 мклобразца перитонеальной жидкости разбавили 450 мкл ФБ.Рис. 2.2. Система генерации свободных радикалов с АБАП в присутствии люминола: I0 – начальный уровень стационарного свечения (до внесения исследуемогообразца плазмы); S – площадь подавляемого свечения за счет действия антиоксидантов; I – уровень стационарного свечения после израсходования антиоксидантов образца; ΔI = I – I0 – разность между уровнем свечения после внесенияобразца и начального уровня стационарного свечения.Для определения антиоксидантного профиля в микропробирку помещали50,0 мкл расствора AБАП 50 мМ (источник свободных электронов) и 20,0 мкллюминола 0,1 мМ (активатор хемилюминесценции). Смесь встряхивали при частоте 1400 об/мин в течение двух минут и выдерживали в течение 20 минут прикомнатой температуре в темноте.
В кювету к смеси AБАП/люминол добавляли920 мкл предварительно нагретого ФБ (37 °C), инициируя реакцию терморазложения источника радикалов. Как только регистрируемое свечение достигало ста-92ционарного уровня (I0) в микропробирку добавляли 10 мкл образца и регистрировали затухание интенсивности свечения вследствие действия антиоксидантовизучаемой жидкости. Далее вновь на кинетической кривой наблюдали нарастанияинтенсивности хемилюминесценции (I). Для визуализации и обработки полученных данных использовали программное обеспечение PowerGraph 3.3.
Типичнаякривая хемилюминесценции при исследовании антиоксидантных свойств плазмыкрови представлена на Рис. 2.2.На втором этапе проводилось изучение свободно-радикального гомеостазаткани яичника, содержащего эндометриодную кисту. В исследование было включено 28 пациенток с эндометриодными кистами яичников.Для определения источников АФК при эндометриодных кистах проводилось изучение их содержимого (n=12).
В экспериментах содержимое кисты разбавляли 100 мМ ФБ раствором, концентрацию гемового железа определяли спектрофотометрически по полосе Соре (409 нм) на спектрофотометре Specord-200(Jena Eng., Германия). Прооксидантную активность определяли в двух модельных системах – с линолевой кислотой и фосфолипидами («Фосфолиповит») – вприсутствии активатора хемилюминесценции кумарина С-334.Для определения свободно-радикального гомеостаза эндометриодной кисты и ткани яичника, прилежащей к эндометриодной кисте (n=38) использоваласьметодика тканевой хемилюминесценции [28, 52].В данном эксперименте образец ткани массой 15±1 мг помещался в кюветудля хемилюминометра, содержащую 1880 мкл раствора Кребса-Рингера (с помощью 4 М соляной кислоты доводили pH раствора до 7,4) и 120 мкл 1 мМ растворалюцигенина. Фоновая хемилюминесценция регистрировалась в течение нескольких минут.
В качестве хемилюминесцентных зондов использовали кумарин C-525(2,3,5,6-1Н,4Н-тетрагидро-9-2,-бензоимидазолил, кумарин C-334, люцигенин (динитрат 10,10-диметил-9,9-биакридиния). После выхода свечения на стационарныйуровень добавляли НАДН, выступающего в роли восстановительного эквивалентапрооксидантных ферментов. НАДН-стимулированная хемилюминесценция регистрировалась в течение 20 минут. На кривых хемилюминесценции определяли93следующие параметры: люцигенин-активированную хемилюминесценцию (I0),НАДН-стимулированную хемилюминесценцию (IНАДН). Коэффициент активациирассчитывали как отношение интенсивности НАДН-стимулированной хемилюминесценции к интенсивности люцигенин-активированной хемилюминесценции(КА = IНАДН/I0). Для визуализации и обработки полученных данных использовалипрограммное обеспечение PowerGraph 3.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
