Диссертация (1174209), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Бисульфитную конверсию ДНКбольных РС и здоровых индивидов проводили при помощи набора EZ DNAMethylation-Gold Kit (Zymo Research) с последующим анализом уровняметилирования ДНК на сканере iScan (Illumina) с использованием чипов InfiniumHumanMethylation450 BeadChip. Оценку уровня метилирования каждого CpGсайта в образце проводили с помощью вычисления показателя бета (beta-value);CpG-сайт считали дифференциально метилированным (ДМС) при сравнении двухгрупп, если абсолютные величины разности средних по группам значенийпоказателя бета были > 0.1, а соответствующая величина p < 0.01. Для оценкивеличиныриспользовалиt-тестСтьюдента,модифицированныйпоэмпирическому методу Байеса и предоставляемый пакетом limma в ПО R.В ходе проведенного исследования было выявлено 136 дифференциальнометилированных CpG сайтов (ДМС), наблюдавшихся при одном или болеепопарном сравнении групп – ППРС, РРС и здоровый контроль (рисунок 3.11.2).НаблюдаетсячеткоеобъединениеобразцовДНКбольныхкаждойизсравниваемых групп в обособленный кластер.
Обнаруживается повышенныйуровень метилирования ДНК в образцах больных ППРС по сравнению как сконтролями, так и с РРС.111Рисунок 3.11.2 - Карты интенсивности сигналов дифференциальнометилированных CpG сайтов (ДМС)При сравнении профилей метилирования ДНК больных РРС и ППРС сконтролями показано, что ППРС характеризуется бóльшими изменениями впаттерне метилирования ДНК, более высоким уровнем метилирования ДНК иболее частой локализацией ДМС в функционально важных областях генома посравнению с РРС (рисунок 3.11.3).При всех сравнениях различия в метилировании затрагивают гены, которыекодируют белки, участвующие в развитии иммунного ответа, а также в регуляциигенной экспрессии.
Кроме того, в случае РРС более выражены изменения вметилировании генов, вовлеченных в демиелинизацию нейронов, а в случаеППРС – в нейродегенерацию. Прямое сравнение РРС и ППРС между собойподтвердило эти выводы и позволило выявить новые группы ДМС-содержащихгенов, которые различают формы между собой. Эти гены участвуют в деградациибелков и межклеточной адгезии. В ходе работы впервые показано вовлечениеметилированияДНКкакэпигенетическогомеханизмавформирование112клинически различных форм РС, причем для ППРС метилирование, судя по всему,приводит к подавлению экспрессии большего числа генов.Рисунок 3.11.3 - Характеристика выявленных ДМС: общее количество,уровень их метилирования и локализацияУчитывая полученные фенотипические различия между пациентами сППРС и другими группами (РРС и АВРС), а также данные по метилированию былпроведен анализ вовлеченности полиморфных вариантов генов иммунного ответав патогенез ППРС.
Для этого были выбраны:1. Гены цитокинов - гены, кодирующие интерлейкины (IL) - IL4 (rs2243250), IL6(rs1800795) и IL17A (rs2275913), изменение уровня экспрессии которыхобнаруживается у больных ППРС;2. Гены, участвующие в процессировании - ген PSMB9 (rs17587), которыйкодирует одну из субъединиц протеасомного комплекса, участвующего впроцессировании антигенов;3. Гены, участвующие в презентации антигенов антиген-презентирующимиклетками (АПК) - ген CLEC16A (rs6498169 - в недавних исследованиях113обнаружена значимая ассоциация с риском развития РС), белковый продукткоторого, член А семейства 16 белков с С-лектиновым доменом (C-type lectindomain family 16 member A), участвует в формировании и транспорте HLA IIпозитивных поздних эндосом в перинуклеарную область и необходим дляпрезентации антигенов АПК;4.
Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) всоседней межгенной областиCLEC16A-SOCS1 (rs1640923 - в недавних исследованиях обнаруженазначимая ассоциация с риском развития РС).Был проведен анализ данных 111 пациентов с ППРС (59 мужчин и 52женщины) в сравнении с материалом, полученным от контрольной группы из 234здоровых добровольца без признаков неврологических заболеваний (90 мужчин,144 женщины, средний возраст - 49.0 ± 20.1 лет). Все включенные в группусравнения здоровые индивиды являлись этническими русскими как и основнаягруппа больных ППРС.Были определены частоты аллелей и генотипов всех выбранных для анализаSNP в группах больных ППРС и здоровых индивидов (таблица.
3.11.1). В группеконтроля распределение генотипов всех полиморфных локусов соответствовалоравновесию Харди-Вайнберга для всех SNP. В группе больных ППРС отклонениеот равновесия было зафиксировано для полиморфизма rs17587 в гене PSMB9(p=0,014), что может объясняться вовлечением этого SNP в патогенеззаболевания.К настоящему времени достаточно активно проводятся исследования навыявление генетических маркеров предрасположенности к РРС, в том числеактивно изучается участие полиморфных генов IL4, IL6, IL17A, PSMB9),CLEC16A и межгенной области CLEC16A-SOCS.
Нами был впервые проведенанализ ассоциации носительства полиморфных вариантов генов IL4, IL6, IL17A,PSMB9,CLEC16AимежгеннойобластиCLEC16A-SOCS1спредрасположенностью к ППРС (таблица 3.11.1). Для анализа ассоциацииаллельного полиморфизма генов иммунного ответа с предрасположенностью кППРС рассматривались три основные модели наследования [106]:1141. Доминантная модель предполагает разделение исследуемых групп наносителей и не носителей мажорного гомозиготного генотипа с ихпоследующим сравнением;2. Рецессивная – на носителей и не носителей минорного гомозиготногогенотипа;3. Сверхдоминантная – на носителей и не носителей гетерозиготного генотипа.НосительствомажорногогенотипаIL4*С/Cдостовернозначимокоррелировало с высоким риском развития ППРС (p=0.0050, ОШ [95% ДИ] = 2.09[1.25-3.49]), что соответствует доминантной генетической модели.
Использованиесверхдоминантной модели в данном случае то же позволило выявить значимуюкорреляционную связь: гетерозиготный генотип IL4*С/T достоверно чащевстречался в группе контроля (p=0.030, ОШ [95% ДИ] = 0.55[0.32-0.95]). Болеетого, значимость ассоциации, полученной с использованием доминантнойгенетической модели, оказывается на порядок выше.В отношении минорного генотипа CLEC16A*G/G также была обнаруженадостоверная значимая ассоциация с высоким риском развития ППРС (p=0.0083,ОШ [95% ДИ] = 2.20 [1.23-3.93]), что соответствует рецессивной генетическоймодели.Дляостальныхполиморфныхвариантовзначимыходиночныхассоциаций с развитием ППРС выявлено не было (таблица 3.11.1).В последующем был проведен мультилокусный анализ с использованиемпрограммногообеспеченияAPSamplerдлявыявлениясочетанийаллелей/генотипов исследуемых полиморфных локусов, ассоциированных спредрасположенностью к ППРС [106] (таблица 3.11.2). Выявлена достовернаязначимаяассоциациясППРСдвухбиаллельныхсочетаний(CLEC16A*G/G+PSMB9*G) и (IL4*C/C+PSMB9*G), которые помимо SNP в генахCLEC16A и IL4, связанных с ППРС по одиночке, содержат также аллель Gполиморфного варианта гена PSMB9 (p=0.0012, ОШ [95% ДИ] =2.68 [1.46-4.92] иp=0.0016, ОШ [95% ДИ] =2.18 [1.31-3.63], соответственно), существенноповышающий уровень значимости наблюдаемой ассоциации.115Далеебылпроведенанализвозможногонеравновесногосцепленияполиморфных вариантов в гене CLEC16A и соседней межгенной областиCLEC16A-SOCS1, находящихся в одном регионе шестнадцатой хромосомы16p13.13, а также SNP генов PSMB9 и IL17A, расположенных в регионах шестойхромосомы 6p12 и 6p21.3, соответственно.
Относительно высокое значение D’обнаруживается только для полиморфизмов в области 16p13.13 (рисунок 3.11.4).Однако значения r2 для обеих пар SNP были менее 0,1.Белым ромбом обозначена группа со слабым сцеплением (D'<1, LOD<2), розовым – группа со значительнымсцеплением (D'<1, LOD>2), группы с сильным сцеплением (D' = 1, LOD>2) на рисунке отсутствуют. Внутрицветных ромбов указано значение D’.Рисунок 3.11.4 - Результаты анализа неравновесного сцепления междуполиморфными вариантами в гене CLEC16A (rs6498169) и в межгеннойобласти CLEC16A-SOCS1 (rs1640923) (локус 16p13.13), а также в генахPSMB9 (rs17587) и IL17A (rs2275913) (локусы 6p21.3 и 6p12, соответственно)Для проведения сравнительного анализа между группами ППРС, АВРС иРРС (группа контроля для ППРС и АВРС в последующем) были выбраны те жеполиморфные варианты генов, по которым проводилось сравнение больныхППРС и здоровых добровольцев ранее: гены цитокинов (гены, кодирующие IL -116IL4 (rs2243250), IL6 (rs1800795) и IL17A (rs2275913)); гены, участвующие впроцессировании (ген PSMB9 (rs17587)); гены, участвующие в презентацииантигенов антиген-презентирующими клетками (ген CLEC16A (rs6498169);Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) всоседней межгенной областиCLEC16A-SOCS1 (rs1640923).Согласно проведенному анализу в группе больных АВРС по сравнению сППРС достоверно чаще встречался гетерозиготный генотип IL4*С/T (χ2=3,81,р=0,050) (таблица 3.11.3).
Носительство аллеля Т приводит к повышенномусинтезу IL4 в клеточной линии Т-лимфоцитов человека. Также значимыеразличия были выявлены и по гену PSMB9 – в группе больных АВРС чащеотмечался гомозиготный генотип PSMB9*А/А, чем в группе больных ППРС(χ2=4,52, р=0,0336). Наличие минорного аллеля A вызывает замену аргинина нагистидин в позиции 60 субъединицы 9 протеасомного комплекса, что влияет наэффективность процессинга антигенов.117Таблица 3.11.1 - Частоты генотипов исследуемых SNP в группах больных ППРС и здоровых индивидовНосители(%)Ген (SNP)ГенотипКонтрольнаяДоминантная модельРецессивная модельСверхдоминантная модельБольныегруппаNN vs (Nn+nn):nn vs (Nn+NN):Nn vs (NN+nn):ППРС(здоровыеЗначение рЗначение рЗначение р(n=111)индивиды)ОШ [95% ДИ]ОШ [95% ДИ]ОШ [95% ДИ]567(n=234)1234C/C85(76.6)141(61.0)IL4T/C23(20.7)74(32.1)p=0.0050p=0.13p=0.030(rs2243250)T/T3(2.7)16(6.9)2.09 [1.25-3.49]0.37 [0.11-1.31]0.55 [0.32-0.95]HWE0.360.15G/G41(37.0)77(33.2)IL6C/G50(45.0)103(44.4)p=0.54p=0.40p=0.91(rs1800795)C/C20(18.0)52(22.4)1.18 [0.74-1.89]0.76 [0.42-1.35]1.03 [0.65-1.62]HWE0.490.12G/G38(34.5)86(38.2)IL17AA/G58(52.8)106(47.1)p=0.55p=0.74p=0.35(rs2275913)A/A14(12.7)33(14.7)0.85 [0.53-1.37]0.85 [0.43-1.66]1.25 [0.79-1.98]HWE0.260.97PSMB9G/G58(52.3)128(57.4)p=0.41p=0.065p=0.096(rs17587)A/G51(46.0)80(35.9)0.81 [0.51-1.28]0.25 [0.06-1.13]1.51 [0.96-2.41]1234A/A2(1.7)15(6.7)HWE0.014*0.60A/A34(30.9)87(37.3)CLEC16AA/G49(44.6)116(49.8)(rs6498169)G/G27(24.5)30(12.9)HWE0.270.36A/A78(70.3)171(75.7)A/G31(27.9)G/GHWECLEC16ASOCS1(rs1640923)ОШ–отношение67p=0.28p=0.0083p=0.420.75 [0.46-1.22]2.20 [1.23-3.93]0.81 [0.51-1.28]49(21.7)p=0.29p=1.00p=0.222(1.8)6(2.6)0.76 [0.46-1.26]0.67 [0.13-3.39]1.40 [0.83-2.36]0.590.28шансов,ДИ–доверительный5118интервал,HWE–значениеpдлятестанасоответствиеравновесиюХарди-Вайнберга.* – значимое отклонение от равновесия Харди-Вайнберга.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
