Диссертация (1174199), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Высвобожденный pNA придает раствору желтое окрашивание, реакция останавливается добавлением уксусной кислоты и измеряется с помощью спектрофотометра. Определение содержания ЛПС с помощью хромогенного анализа по конечной точке основано на том, что интенсивность окрашивания реакционной смеси прямо пропорциональна содержанию ЛПС. На первом этапе в лунки с образцами (50 мкл) вносили по 50 мклрастворенного ЛАЛ-реактива, в лунки с контролями образцов вместо ЛАЛреактива вносили по 50 мкл чистой воды, свободной от ЛПС.
Проводили инкубацию 30 минут при комнатной температуре, после чего останавливали реакцию добавлением (50 мкл) разведенного стоп-раствора, содержащую 50% уксусную кислоту. Исслледование проводили на спектрофотометре «Bio RadiMark» (США) при длине волны 405 нм. Концентрацию ЛПС в образцах определяли по калибровочной кривой на основе стандартных концентраций эндотоксина: 10; 3.30; 1.10; 0.40; 0.12; 0.04; 0.01; 0,0 ЕU/мл. Плазменная концентрация ЛПС в норме составляет от 0-1 ЕU/мл [319].852.2.6. Определение в плазме крови белка, связывающего липополисахаридыДля количественного определения LBP в плазме крови был использован набор Hbt Human LBP ELISA (Голландия), предназначенный для твердофазного ИФА, основанного на принципе «сэндвича».
Минимальное количество LBP в плазме крови, определяемое данным набором составляло 1 нг/мл.Материал: 2 мл крови из вены натощак. Испытуемые пробы – ЭДТА плазмыхранили в морозильной камере при температуре минус 200С. Образцы переданализом разводили в 4 раза поставляемым буфером для разведения, которыйсодержал 8 мМ Мg и блокировал влияние ЛПС на измерения концентрацииLBP.
Оценку результатов проводили на спектрофотометре «Bio Rad iMark»(США) при длине волны 450 нм. Стандартную кривую получали путем построения графика зависимости оптической плотности от соответствующейконцентрации 8 стандартов: 50,0; 33,0; 22,0; 14,8; 9,9; 6,6; 4,40; 0,0 нг/мл.Нормальное содержание LBP в крови составляет около 10 мкг/мл.2.2.7.Определение в плазме крови бактерицидного белка, повышающего проницаемость мембранДля количественного определения BPI, в плазме крови использовалинабор Hbt human BPI ELISA (Голландия), основанный на «сэндвич» методетвердофазного ИФА. Минимальное количество BPI в плазме крови, котороеможно определить с помощью данного набора составляет 250 пг/мл.Материал: 2 мл плазмы крови из вены натощак.
Испытуемые пробы – ЭДТАплазмы хранили в морозильной камере при температуре минус 20 0С. Передиспользованием осуществляли разведение образцов в 5 раз буфером для разведения, содержащим 80 мМ Mg, который блокирует влияние ЛПС на измерения BPI. Оценку результатов проводили с помощью спектрофотометра«Bio Rad iMark » (США) при длине волны 450 нм. Стандартную кривую получали путем построения графика зависимости оптической плотности от соответствующей концентрации: 3,088; 2,517; 1,113; 0,627; 0,315; 0,198; 0,193;0,139 нг/мл. В плазме здоровых доноров уровень BPI не более 0,5 нг/мл.862.2.8.
Определение в плазме крови растворимого CD14Для количественного определения sCD14 в плазме крови использовалинабор Hbt human sCD14 ELISA (Голландия), основанный на «сэндвич» методе твердофазного ИФА. Минимальное количество sCD14 в плазме крови, которое можно определить с помощью данного набора, составляет 2 нг/мл,диапазон измеряемых концентраций от 2 до 100 нг/мл.Материал: 2 мл плазмы крови из вены натощак. Испытуемые пробы – ЭДТАплазмы хранили в морозильной камере при температуре минус 20 0С.
Передиспользованием разводили образцы в 100 раз буфером. Оценку результатовпроводили с помощью спектрофотометра «Bio Rad iMark » (США) при длиневолны 450 нм. Стандартную кривую получали путем построения графика зависимости оптической плотности от соответствующей концентрации 8 стандартов: 3,093; 2,081; 1,557; 0,768; 0,467; 0,320; 0,244; 0,151 нг/мл. В нормеsCD14 присутствует в плазме в концентрации 2-4 мкг/мл.2.2.9. Определение в плазме крови IgG к core-региону липополисахаридовДля количественного определения IgG к core-региону ЛПС в плазмекрови использовали набор Hbt EndoCab ELISA (Голландия), основанный на«сэндвич» методе твердофазного ИФА.Материал: 2 мл плазмы крови из вены натощак.
Испытуемые пробы – ЭДТАплазмы хранили в морозильной камере при температуре минус 20 0С. Передиспользованием осуществляли разведение плазмы крови 1:200. ИФА исследования проводили на спектрофотометре «Bio Rad iMark » (США) при длиневолны 450 нм. Стандартную кривую получали путем построения графика зависимости оптической плотности от соответствующей концентрации 8 стандартов: 8,0; 4,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,3; 0,1; 0,0 MU/мл.Стандартные единицы IgG к core-региону ЛПС (MU) рассчитаны черезмедианы значений, полученных для 1000 взрослых, проживающих в однойместности. Установленная нами концентрация IgG к core-региону ЛПС уздоровых женщин фертильного возраста составляла 52 (14-144) MU/мл.872.2.10. Определение в плазме крови иммуноглобулинов классов А, M и GОпределение концентраций IgA, IgM и IgG проводили с помощьюнаборов («Вектор-Бест», Россия) с применением метода, основанного натвердофазном «сэндвич» варианте ИФА.Материал: 2 мл плазмы крови из вены натощак.
Испытуемые пробы – ЭДТАплазмы хранили в морозильной камере при температуре минус 20 0С. Определение проводили в два этапа. На первом этапе калибровочные образцы cизвестными концентрациями IgA, IgM, IgG и анализируемые образцы инкубировали в лунках стрипированного планшета с иммобилизованными моноклональными антителами (мКАТ) к IgA, IgM, IgG.
Затем планшет отмывался. На втором этапе, связавшиеся в лунках IgA, IgM, IgG, обрабатываликонъюгатом мКАТ. После отмывания избытка конъюгата, образовавшиесяиммунные комплексы «иммобилизованные мКАТ – Ig – конъюгат» выявлялиферментативной реакцией пероксидазы с перекисью водорода в присутствиихромогена. Интенсивность окраски хромогена пропорциональна концентрации Ig в анализируемом образце.
После остановки пероксидазной реакциистоп-реагентом результаты учитывали фотометрически. Концентрацию IgA,IgM, IgG определяли по калибровочному графику. Исследование проводилина спектрофотометре «Bio Rad iMark» (США) при длине волны 450 нм. Постандартной калибровочной кривой определяли искомую концентрацию Igметодом, соответствующим кучно-линейной аппроксимации. Диапазон концентрации в сыворотке крови здорового донора, начиная с 15 лет, составляетдля IgA – 0,8–4,0 г/л, IgM – 0,5–2,0 г/л, IgG – 5,3–16,5 г/л.2.2.11.
Определение в плазме крови С-реактивного белкаДля количественного определения СРБ в плазме крови использовалинабор с высокой чувствительностью hsCRP ELISA, «Biomerica» (Австрия).Принцип теста основан на методе твердофазного ИФА, в котором использовали мышиные и козьи моноклональные антитела к СРБ. Образцы инкубировали одновременно с двумя типами антител.88Материал: 2 мл плазмы крови из вены натощак.
Испытуемые пробы – ЭДТАплазмы хранили в морозильной камере при температуре минус 20 0С. Передиспользованием осуществляли разведение 1:100 образцов плазмы. Абсорбцию измеряли спектрофотометрически при длине волны 450 нм на анализаторе «Bio Rad iMark» (США). Стандартную кривую получали путем построения графика зависимости оптической плотности от соответствующей концентрации 6 стандартов: 0,100, 0,50, 0,25, 0,10, 0,005, 0,000. В норме концентрация СРБ в плазме крови составляет около 1 мкг/мл.2.2.12. Определение в плазме крови цитокинов IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL10, IFN-γ, TFN-αДля определения концентрации цитокинов (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8,IL-10 IFN-γ, TFN-α) в плазме использовали метод, основанный на твердофазном «сэндвич» – варианте ИФА с применением моно- и поликлональных антител, сорбированных на поверхности лунок разборного полистирольногопланшета ( «Вектор-Бест», Россия).Материал: 2 мл плазмы крови из вены натощак.
Испытуемые пробы – ЭДТАплазмы хранили в морозильной камере при температуре минус 20 0С. На первой стадии анализа образцы инкубировали в лунках с иммобилизованнымиантителами. Присутствующий в образце цитокин связывался с иммобилизованными антителами. Несвязавшийся материал удаляли отмывкой. Связавшийся цитокин взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 IFN-γ, TFN-α человека с биотином).Несвязавшийся конъюгат №1 удаляли отмывкой. На третьей стадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №2(стрептавидин с пероксидазой хрена). После третьей отмывки количествосвязавшегося конъюгата №2 определяли цветной реакцией с использованиемсубстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина.
Реакцию останавливали добавлением стоп-реангента и измеряли оптическую плотность растворов при длине волны 450 нм с помощьюспектрофотометра «Bio Rad iMark» (США). По стандартной калибровочной89кривой определяли искомую концентрацию цитокинов. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образцецитокина. Нормальное содержание цитокинов в плазме крови составляет: IL1β – 0-11 пг/мл; IL-2 – 0-10 пг/мл; IL-4 – 0-10 пг/мл; IL-6 – 0-10 пг/мл; IL-8 –0-10 пг/мл; IL-10 – 0-31 пг/мл; IFN-γ – 0-10,0 пг/мл, TFN-α – 0-10,0 пг/мл.2.2.13.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
