Диссертация (1174199), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Методы исследования80Всем принимающим участие в исследовании женщинам было проведено общеклиническое обследование с применением рутинных методик (рис.4), регламентированных действующими нормативными документами, включающих дополнительные лабораторные и функциональные методы исследования. Специальное обследование было проведено на втором этапе работы246 пациенткам фертильного возраста.2.2.1. Общеклинические методы исследованияОбщеклиническое обследование включало в себя подробный сборанамнеза с помощью стандартного опроса, общее физикальное исследованиеорганов дыхания, кровообращения, пищеварения, мочевыводящей системы,молочных желез, антропометрию (измерение роста, массы тела, ИМТ). Принаружном акушерском осмотре определяли окружность живота, высоту днаматки и наличие тонуса, проводили пальпацию и аускультацию плода с помощью фетального допплера BabyCare (Bionet, Южная Корея).
Все измерения сравнивали с нормативными показателями, установленными для каждогогестационного срока. Во время объективного гинекологического осмотра,включающего осмотр при помощи зеркал, оценивали характер выделений,состояние вульвы, влагалища, шейки матки, регионарных лимфатических узлов. Проводили pH-метрию цервико-вагинальной среды с помощью полосок«Кольпо-тест рН» (производитель ООО «ЭКС ЭКВО», Россия). Производилизабор двух типов биоматериала: соскоб цервикального эпителия и вагинальное отделяемое. Оценку вагинальной микробиоты осуществляли бактериоскопическим, бактериологическим, молекулярно-биологическим методами.Показатели крови (гемоглобина, уровня эритроцитов, лейкоцитов,тромбоцитов, гематокрита, СОЭ, лейкоформулы) определяли на гематологических анализаторах «KX-21» фирмы SYSMEX (Япония) и МЕК 6400 (NihonKohden, Япония), уровень биохимических параметров устанавливали на биохимическом анализаторе «LIASIS» фирмы AMS (Италия) и «Sapphire-400»(Hirose Electrinic System, Япония).
Иммуноферментные (ИФА) исследованияпроводили с применением реактивов и оборудования ведущих производите81лей, в том числе на микропланшетном ридере Bio Rad iMark (США). Состояние МВС оценивали по общему анализу мочи, анализу мочи по Нечипоренко, Зимницкому и пробе Реберга.Регистрировали исходы беременности и родов каждой пациентки, втом числе срок и способ родоразрешения, патоформологию последов, проводили антропометрию новорожденных и оценку состояния по шкале Апгар.2.2.2. Бактериоскопия мазков цервико-вагинального отделяемогоМикроскопическое исследование окрашенных по Граму мазков цервикального и вагинального отделяемого, полученного из заднего свода, проводили на микроскопе Люмам-Р8 (ЛОМО, г.
Санкт-Петербург). При микроскопии окрашенных мазков оценивали морфотипы микробных клеток, наличие ивыраженность лейкоцитарной реакции, число эпителиальных клеток, «ключевых» клеток, наличие элементов грибов, трихомонад.2.2.3. Культуральное исследование цервико-вагинальной микробиотыВзятие отделяемого из влагалища осуществляли стерильным ватнымтампоном из заднего свода до проведения влагалищного исследования. Взятый материал помещали в стерильную пробирку и доставляли в бактериологическую лабораторию не позднее, чем через 1-2 часа после забора, или помещали в пробирку с буфером и доставляли в течение суток.
В лабораторииготовили серийные разведения в пробирках из расчета 1:10. Посев производили на ряд питательных сред, позволяющих выявить максимально возможный спектр микроорганизмов. Посевная доза на жидких питательных средахсоставляла 0,5-1,0 мл, на плотных – 0,1 мл. Для культивирования использовали сухие коммерческие питательные среды, выпускаемые фирмами НПО«Питательные среды» (Россия); «Вio-Merieux» (Франция). Культивировалимикроорганизмы в термостате при 370С, дрожжеподобные грибы при температуре 220С. Микроаэрофилы выращивали в эксикаторах с использованиемгаз-паков GEN bag anaer «Вio-Merieux» (Франция).
Производили подсчет выросших колоний (КОЕ) и пересчет на 1 мл биоматериала (КОЕ/мл).82Идентифицировали микроорганизмы по биохимическим признакам сиспользованием коммерческих тест-систем: «ЛАХЕМА» Чехия (Strepto-test,Stafi-test, Entero-test, EnteroRapid-test, Neferm-test); «Bio Merieux» Франция(ID 32 E, ID 32 Staf, ID 32 Strep, ID 32 GN, ID 32 Cand, ID 32 A); НПО «Диагностические системы» г. Н.Новгород (ПБДЕ, ПБДС).Чистые культуры выделяли на 5% кровяном агаре, желточно-солевомагаре, средах Эндо и Сабуро, МРС.
Посевная доза составляла 0,1 мл, разведения 101-108. Биохимическую идентификацию проводили на микробиологическом анализаторе АТВ «Expression» фирмы «Био-Мерье» (Франция).Бактериологические исследования выполняли в соответствии с Приказом № 535 МЗ СССР от 22.12.1985 г. «Об унификации микробиологическихметодов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».
При концентрации УПМ 103КОЕ/мл и выше, и обнаружении облигатных патогенов, результат выносили взаключение протокола исследования. Интерпретацию результатов проводилис учетом клинических проявлений, данных микроскопического и молекулярно-биологического методов исследования вагинальной микробиоты.2.2.4. Метод полимеразной цепной реакции в реальном времениДля проведения анализа методом ПЦР в реальном времени производили забор вагинального отделяемого из заднего свода влагалища урогенитальным зондом (цитощеткой), рабочую часть которого отделяли по насечке иоставляли в пробирке с «Транспортной средой с муколитиком», объёмом 0,5мл (Россия). Транспортировку материала в лабораторию осуществляли прикомнатной температуре в соответствии с инструкцией производителя.ПЦР - исследование состояло из следующих этапов:1) экстракция ДНК из исследуемых образцов с использованием сорбентнойметодики с применением набора реагентов ДНК-Сорб-АМ (Россия).2) амплификация ДНК c гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» на приборе Rotor-Gene 6000 (Corbett Research,Австралия) в соответствии с инструкцией производителя.833) анализ и интерпретация результатов.Выявление основных возбудителей инфекций органов репродукции методом мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекциейпродуктов амплификации в режиме «реального времени» в пробах ДНК, полученных путем экстракции из соскобов, проводили с помощью тест-систем:1) набор «АмплиСенс® Флороценоз/Бактериальный вагиноз-FL», предназначенный для диагностики БВ на основании расчета соотношений между общим количеством бактерий, лактобактерий и УПМ, ассоциированных с БВ(G.vaginalis, A.vaginae) в биологическом материале [54];2) набор «АмплиСенс®Флороценоз/Аэробы-FL», предназначенный для количественногоопределенияДНКэнтеробактерий(семействаEnterobacteriaceae, включая E.coli, Klebsiella spp., Proteus spp.
и др.), стафилококков (Staphylococcus spp.) и стрептококков (Streptococcus spp.) [151];3) набор реагентов «АмплиСенс® Флороценоз/Кандиды-FL», предназначенный для количественного определения ДНК 5 видов грибов рода Candida:C.albicans, C.glabrata, C.krusei, C.parapsilosis и C.tropicalis [20];4) набор «АмплиСенс® Флороценоз/Микоплазмы-FL», предназначенный дляколичественного определения ДНК U.parvum/urealyticum и M.hominis [62];5) набор реагентов «АмплиСенс® N.gonorrhoeae/C.trachomatis/ M.genitalium/T.vaginalis МУЛЬТИПРАЙМ-FL», предназначенный для одновременноговыделения ДНК N.gonorrhoeae, C.trachomatis, M.genitalium и T.vaginalis.Полученные значения концентраций ДНК микроорганизмов выражалив виде геномных эквивалентов в миллилитре (ГЭ/мл).
Для получения заключения по результатам исследования использовали программное обеспеченияв формате Microsoft Excel для автоматической обработки данных и получения результатов комплексного исследования «Флороценоз» (версия 1.0)2.2.5. Определение липополисахаридов в плазме кровиКонцентрацию ЛПС в плазме определяли с помощью хромогенногометода по конечной точке с использованием реактива Limulus Hbt LAL (Голландия).
Предел чувствительности метода составляет 0,01 ЕU/мл.84Материал: 2 мл плазмы крови. Испытуемые пробы – ЭДТА плазмы хранилив морозильной камере при температуре минус 200С. Для устранения влиянияфакторов интерференции использовали разведение образцов плазмы крови1:200 водой для ЛАЛ-теста и предварительное инкубирование в водяной банепри 75°С в течение 5 минут.
Проверка на наличие мешающих факторов (ингибирование/усиление реакции) проводилась путем добавления ЛПС к образцу или разведения образца раствором ЛПС с известной концентрацией.ЛПСПроферментСвертывающий ферментСвертывающий ферментСубстратПептид + р-нитроанилинБиологический принцип метода основан на том, что ЛПС приводят кактивации профермента, содержащегося в лизате амебоцитов Limulus (ЛАЛ).Активный свертывающий фермент разрезает коагулоген, что приводит к помутнению реакционной смеси. В присутствии хромогенного субстрата (S2423) свертывающий фермент отрезает от субстрата хромофор, рнитроанилин (pNA).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
