Диссертация (1154740), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Сравнить выраженность воспалительной реакции стенки мочевого пузыряи окружающих тканей при подшивании к его стенке мембран, изготовленных изколлагена I типа, выделенного из тканей свиньи и крупного рогатого скота.2. Провести сравнительную оценку способности свиных и бычьихколлагеновых мембран инкорпорироваться в состав стенки мочевых путей послезаместительной пластики.3. Оценить гистологические изменения в зоне имплантации свиных ибычьих коллагеновых мембран, как в прилежащих отделах стенки мочевого8пузыря и уретры, так и в имплантатах.4.Изучитьвлияниевключениявсоставколлагеновыхмембранкондиционированной среды культивирования мезенхимальных стволовых клетокжировой ткани человека на регенерацию новообразованной стенки мочевогопузыря после его резекции.5.Оценитьвыраженностьваскуляризациииклеточныйсоставимплантированных в мочевой пузырь коллагеновых мембран, содержащих и несодержащих кондиционированную среду культивирования мезенхимальныхстволовых клеток жировой ткани человека.6.
Сравнить функциональное состояние резецированного мочевого пузыряпосле заместительной цистопластики коллагеновой мембраной, содержащей и несодержащей кондиционированную среду культивирования мезенхимальныхстволовых клеток жировой ткани человека, а также при простом ушиваниирезецированного мочевого пузыря.Научная новизна. Получены приоритетные данные о биологическихсвойств мембран из коллагена 1-го типа выделенных из тканей свиней и крупногорогатого скота. Выявлены преимущества использования мембран из свиногоколлагена.Доказано,чтовключениевсоставколлагеновоймембраныкондиционированной среды культивирования мезенхимальных стволовых клетокчеловека способствует более полноценной эпителизации имплантата, ускорениюегореваскуляризации,болееполноценнойрегенерациимышечногослояновообразованной стенки мочевого пузыря и препятствует инкрустации солеймочи на неэпителизированной внутренней поверхности.
Выявлено болееполноценноевосстановлениефункциональногообъемаорганаиегокомплаентность, оцененные методом инфузионной цистометрии, при включении всостав мембраны кондиционированной среды культивирования мезенхимальныхстволовых клеток жировой ткани человека. Доказана возможность клиническогопримененияколлагеновогоимплантатадлязаместительнойпластикимочеточника.Теоретическая и практическая значимость. Доказана эффективность9использования методики цистопластики для изучения пригодности различныхколлагеновых биоматериалов материалов для заместительной пластики мочевыхпутей. Определен оптимальный вид коллагена, вызывающий минимальнуювоспалительнуюреакциюокружающихтканей,которыйможетбытьрекомендован для изготовления материала для цистопластики. Обоснованацелесообразностьвключениявсоставколлагеновыхмембранкондиционированной среды культивирования мезенхимальных стволовых клетокжировой ткани человека для обеспечения полноценной регенерации стенкимочевого пузыря и сохранения ее функции.
Проведена апробация заместительнойпластики мочевых путей в клинике с использованием биопротеза мочеточника изколлагена I типа. Сформулированы рекомендации по дальнейшим исследованиямвозможности использованияколлагеновых материалом для расширяющейцистопластики, в том числе и в клинической практике.Методология и методы исследования. Экспериментальные исследованияпроведены на 48 Ново-Зеландских кроликах-самцах массой 3-3,5 кг, в возрасте 4-5месяцев. Животных содержали в стандартных условиях вивария на рационе изспециального комбикорма с неограниченным доступом к воде.
Все экспериментыпроводили с соблюдением принципов Европейской конвенции о гуманномотношении к животным. Опыты обязательно проводились в условиях общегообезболивания. Эвтаназию животных производили избыточным введениемнаркотического вещества (тиопентала натрия).Исследование состояло из 2 этапов. На первом этапе оценивалибиологическую совместимость и способность интегрироваться в ткани мочевогопузыря 2 вариантов мембран из коллагена 1-го типа, изготовленных из тканейкрупного рогатого скота (бычий коллаген) или из тканей свиньи, с целью выборанаиболее подходящего варианта коллагенового материала. Для этого коллагеновыемембраны подшивали к наружной стенке мочевого пузыря (12 кроликов по 6животных в каждой группе) или замещали ими сформированный дефект стенки(18 кроликов, по 9 животных в каждой группе) и через определенные интервалывремени оценивали выраженность тканевой реакции на имплантат при10макроскопической оценке и гистологическом исследовании ткани мочевогопузыря.На втором этапе оценивали возможность использования препаратовколлагена 1-го типа для заместительной пластики мочеиспускательного канала имочевого пузыря.
В опытах с пластикой уретры коллагеновую трубку вшивали вобласти дефекта уретры, образовавшегося после ее пересечения и расхождениякраев (4 кролика). При заместительной пластике мочевого пузыря коллагеновоймембраной замещали дефект стенки мочевого пузыря, образовавшийся после егорезекции. При этом в части опытов использовали стандартную коллагеновуюмембрану (5 кроликов), а в других экспериментах — мембрану с включенной в еесостав кондиционированной средой культивирования мезенхимальных стволовыхклеток жировой ткани человека (МСК ЖТ), содержащей комплекс факторов роста,цитокинов и других сигнальных молекул, способный стимулировать регенерациюновообразованной стенки мочевого пузыря (5 кроликов).Контролем к этой части исследований служили опыты, в которыхвыполняли только резекцию мочевого пузыря с его ушиванием (4 кролика).Таким образом, было проведено 6 серий экспериментов.1-я серия – сравнительная оценка биосовместимости препаратов коллагена1-го типа, изготовленного из тканей крупного рогатого скота (бычий коллаген) исвиней на модели их подшивания к наружной стенке мочевого пузыря;2-я серия – сравнительная оценка способности к интеграции в тканьмочевого пузыря мембран, изготовленных из бычьего или свиного коллагена 1-готипа после замещения ими дефекта его стенки;3-я серия – изучение возможности заместительной пластики уретрытрубчатым препаратом коллагена 1-го типа;4-я серия – оценка возможности использования нативных мембран изсвиного коллагена 1-го типа для заместительной пластики мочевого пузыря послеего резекции;5-ясерия–оценкаколлагеновыхмембран,содержащихкондиционированную среду культивирования мезенхимальных стволовых клеток11жировой ткани человека в качестве материала для заместительной пластикимочевого пузыря после его резекции;6-я серия – резекция мочевого пузыря с его ушиванием.Из эксперимента животных выводили на 3-и, 7-е, 14-е, 21-е и 30-е суткипосле операции.
Распределение животных по сериям и срокам наблюденияпредставлено в Таблице. 1.Таблица 1 — Распределение животных по сериям и срокам наблюденияСерии опытов1-я серия2-я серия3-я серия4-я серия5-я серия6 серияВсего344Сроки наблюдения (дни)71421446662210146Всего кроликов30554141218455448Коллагеновые мембраны были изготовлены по следующей методике.Стерильный прозрачный нейтральный раствор коллагена 1-го типа, выделенногоиз тканей животных («ВИСКОЛЛ», производство ООО «Имтек», Россия), вобъеме 1 мл помещали в стерильную культуральную чашку с площадьюповерхности 2 см2.
Затем чашку перемещали в CO2-инкубатор и инкубировалипри +370 С до тех пор, пока не формировался гидрогель, который в дальнейшемподвергали сушке в асептических условиях при температуре от +200 С до +250 С втечение 7 дней. Процесс сушки считали полностью завершенным, когда гидрогельпереходил в форму жесткого стеклоподобного материала. Полученные такимобразом мембраны расфасовывали в индивидуальную стерильную упаковку ссоответствующей маркировкой (Рисунок 1).МСК выделяли из подкожного жирового отложения здоровых доноровобоих полов, полученного при проведении малого хирургического вмешательствапод местной анестезией или в ходе плановых хирургических операций.Полученный в результате операции биоматериал в стерильных условиях12Рисунок 1 — Внешний вид стерильной упакованной коллагеновой мембраныламинарного бокса измельчали сосудистыми ножницами до консистенциисуспензии мелких (размером не более 2 мм3) кусочков и смешивали с растворамиферментов коллагеназы I типа (200 ед/мл, «Worthington Biochemical», США) идиспазы (40 ед/мл, «Sigma», Германия) при соотношении объема ткани (в мл) кобъему ферментативного раствора (в мл) 1:2.
Образец инкубировали при 37°C втечение 30-45 мин при постоянном встряхивании. По окончании инкубациидобавляли равный объем среды роста МСК и центрифугировали при 200 g втечение 8 мин. Белесый поверхностный слой, состоящий из зрелых адипоцитов икусочков ферментативно необработанной ткани, удаляли с помощью вакуумногонасоса, а осадок, состоящий из клеток стромы жировой ткани, клеток сосудистойстенки и крови, суспендировали в стерильной деионизированной воде длялизирования эритроцитов. Чтобы восстановить осмотическое давление, добавлялисоответствующий объем 10-кратного фосфатного буфера, а затем фильтроваличерез нейлоновые фильтры с размером пор 100 мкм («BD Falcon Cell Strainer»,США) и центрифугировали при 200 g 5 мин. Супернатант удаляли, а осадокресуспендировали в среде, поддерживающей рост недифференцированныхмезенхимных прогениторных клеток человека (Advance Stem Cell Basal Medium,далее – AdvanceSM, «HyClone», США), содержащей 10% смеси факторов роста(AdvanceStemCellGrowthSupplement,«HyClone»)и100Ед/мл13пенициллина/стрептомицина («HyClone»).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
