Диссертация (1154740), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Выделенные клетки высаживали начашки Петри («Corning», США) в концентрации 5х104/см3 и инкубировали в СО2инкубаторе (5% СО2; 95% воздуха) при 37°С. На следующий день в чашкахменяли среду для удаления не прикрепившихся клеток. Смену среды проводиликаждые 2-3 дня; при достижении 70-80% конфлюента клетки рассаживали всоотношении 1:3 с использованием раствора QTase (HyClone). Жизнеспособностьклеток оценивали путем окраски клеток раствором трипанового синего и подсчетаколичества живых и мертвых клеток с помощью счетчика клеток (Cell Counter,«Invitrogen», США).Для получения кондиционированной среды МСК ЖТ 4-5 пассажа,достигшие(«ПанЭко»,80%конфлюента,Россия).КпромываличашкамтрехкратнодобавлялисредурастворомХэнксаDMEM-LG.Клеткикультивировали в течение 7 дней, после чего кондиционированную средусобирали, очищали от клеточного дебриса путем центрифугирования в течение10 мин при 300g, затем концентрировали в 50 раз с помощью ультрафильтрациичерез мембраны из регенерированной целлюлозы с указанным отсечением 10 кДав центрифужных картриджах («Millipore», США).Для получения биоматериала смешивали 2,5% свиной стерильныйнейтральныйколлагеновыйгель(«ИМТЕК»,Россия)собразцамиконцентрированной в 50 раз КС МСК ЖТ в соотношении по объему 4:1.
Затеминкубировали смесь при +4°С в течение 2 часов. Полученный раствор равномернораспределяли на дне лунки 24-луночного планшета с площадью поверхностиоколо 2 см2, помещали планшет в CO2-инкубатор и инкубировали при +37°С втечение 30 минут, пока не сформируется гидрогель. Приготовленный гидрогель впланшете высушивали в асептических условиях при температуре +37°C дополного высыхания. Процесс сушки считали полностью завершенным, когдагидрогель переходил в форму жесткого стеклоподобного материала. Контрольныемембраны готовили по такому же протоколу, добавляя вместо КС МСК ЖТсоответствующее количество среды DMEM-LG.14Все операции на кроликах проводили в условиях наркоза.
Для наркозаиспользовали смесь препаратов Золетил 100 производства Virbac S.A. и XylaVETprofessional(ксилаветинъекционный)производстваPharmamagistKftвсоотношении 2:1. Рабочий раствор доводили до концентрации Золетила 30 мг/млдобавлением физиологического раствора. Полученный раствор вводили вконцентрации 1мл/кг внутримышечно.Для профилактикиинфекционных осложненийвводилиантибиотик(амоксиклав 200 мг внутривенно однократно).Методика подшивания коллагеновой мембраны к стенке мочевого пузыря.После соответствующей подготовки операционного поля проводили нижнесрединную лапаротомию и в рану выводили мочевой пузырь.
При необходимостидля полной мобилизации мочевого пузыря пересекали соединительнотканныесвязки, соединяющие пузырь с боковыми стенками брюшной полости, а такжеотделяли перивезикальную жировую ткань.На наружной поверхности мочевого пузыря выбирали бессосудистыйучасток и подшивали коллагеновую мембрану отдельными узловыми швамиатравматической нитью « Vicryl» 4/0. Обычно накладывали 6 узловых швов наравном расстоянии (Рисунок 2).Рисунок 2 — Внешний вид коллагеновой мембраны,подшитой к наружной стенке мочевого пузыря15После этого мочевой пузырь погружали в брюшную полость и ушивалилапаротомную рану, используя непрерывный обвивной шов для ушиваниямышечной стенки и отдельные узловые швы на кожу атравматической нитью«Vicryl» 2/0.Методика замещения коллагеновой мембраной дефекта стенки мочевогопузыря. После введения в наркоз катетеризировали мочевой пузырь по уретре дляэвакуации мочи и определения исходной функциональной емкости мочевогопузыря.
В бессосудистой зоне иссекали участок стенки органа размером примерно2 х 2 см, что соответствовало размерам коллагеновой мембраны (Рисунок 3А).Мембрану вшивали в область дефекта непрерывным обвивным швом сиспользованием атравматической нити «Vicryl» 4/0 (Рисунок 3Б).АБРисунок 3 — Внешний вид резецированного мочевого пузыря, подготовленногок имплантации мембраны (А) и после ее имплантации (Б)Мочевой пузырь помещали в брюшную полость и ушивали лапаротомнуюрану двухрядным швом: непрерывный обвивной шов на мышечную стенку иотдельные узловые швы на кожу с использованием атравматической нити«Vicryl» 2/0. Мочевой пузырь дренировали уретральным катетером.Методика резекции мочевого пузыря с его ушиванием. В этих опытахпроизводили резекцию мочевого пузыря, как в предыдущих сериях, нообразовавшийся дефект ушивали непрерывным обвивным швом атравматическойнитью «Vicryl» 4/0.
Дальнейший ход операции — как в других сериях.Методика пластики уретры трубчатым коллагеновым протезом. В опытах с16пластикой уретры катетеризировали ее полиэтиленовым катетером; рассекали кожупрепуция и слизистую оболочку полового члена и выделяли уретру, которую бралина держалку (Рисунок 4А). Катетер временно удаляли. Подготавливали трубчатыйколлагеновый протез (Рисунок 4Б), после чего уретру пересекали. В образовавшийсяпосле расхождения краев дефект помещали коллагеновый имплантат, которыйанастомозировали на вновь введенном катетере с краями уретры, используяотдельные узловые швы атравматичной нитью «Vicryl» 4/0 (Рисунок 4В).
Кожнуюрану ушивали отдельными узловыми швами нитью «Vicryl» 4/0.БАВРисунок 4 — Этапы пластики уретры кролика коллагеновым имплантатомОценка результатов пластики мочевых путей. В заданные сроки животныхвновь вводили в наркоз. В опытах с цистоплатикой выполняли лапаротомию,проводили макроскопическую оценку состояния мочевого пузыря и окружающих17тканей, выполняли функциональные исследования и в конце экспериментаудаляли мочевой пузырь для гистологического исследования.
В опытах суретропластикой после визуального осмотра области операции выполнялиуретрографию или фистулографию, после чего удаляли уретру с имплантатом длягистологического исследования.В опытах с цистопластикой при визуальном осмотре области операцииобращали внимание на выраженность спаечного процесса мочевого пузыря сокружающими тканями, наличие экссудата в брюшной полости, внешний видмочевого пузыря (степень гиперемии, отечность, ригидность стенки), а такжеколлагеновой мембраны.
После удаления и вскрытия мочевого пузыря отмечалистепеньгиперемиииотечностислизистойоболочки,прилегающейкимплантированной мембране, визуально оценивали площадь мембраны, непокрытой уротелием, а также отмечали наличие или отсутствие инкрустациимембраны солями и образование конкрементов.В опытах с уретропластикой оценивали состояние наружных тканей,наличие мочевых свищей.Для оценки состояния нижних мочевых путей в ряде исследованийвыполняли уретроцистографию с 76% верографином. В опытах с уретропластикойпри выявлении мочевого свища выполняли фистулографию.Функциональные исследования проводили как на интактном мочевомпузыре до начала манипуляций на нем, так и через 1 месяц после цистопластики.Исследования начинали с определения функциональной емкости мочевогопузыря. Для этого мочевой пузырь пунктировали в области верхушкивнутривенным кубитальным катетером G20 и через него опорожняли мочевойпузырь.
После этого мочевой пузырь постепенно наполняли физиологическимраствором до начала подтекания жидкости по уретре или до начала активногомочеиспускания. Объем введенного при этом раствора считали функциональнымобъемом мочевого пузыря.В процессе наполнения мочевого пузыря регистрировали также динамикувнутрипузырного давления. Эти данные использовали для расчета показателя18«объем/давление», характеризующего комплаентность мочевого пузыря.Для дальнейших исследований к поверхности мочевого пузыря подшивали 2хлорсеребряных электрода по обе стороны от имплантированной мембраны. Спомощью этих электродов на специально разработанной высокочувствительнойаппаратуре регистрировали малые колебания биоимпеданса и анализировали спомощью Фурье-преобразования их частотный спектр с помощью оригинальногопрограммного обеспечения.
При одновременной регистрации внутрипузырногодавления через катетер, соединенный с электроманометром, с помощью этойметодики можно оценивать состояние кровообращения в изучаемой областистенки мочевого пузыря, а также функциональное состояние детрузора, в томчисле его возбудимость и спонтанную активность, не связанную с актоммочеиспускания, что является признаком детрузорной гиперактивности.Методика исследования, аппаратный комплекс и программное обеспеченияразработаны в НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткинасовместно с НПФ «Биола» и ее информативность доказана в исследованияхфункционального состояния мочевого пузыря и предстательной железы приразличных патологических состояниях [3, 4, 37, 38, 59]. Внешний вид мочевогопузыря, подготовленного для функциональных исследований, представлен наРисунке 4.Рисунок 4 — Внешний вид мочевого пузыря, подготовленного дляфункциональных исследований (стрелкой указана коллагеновая мембрана)19Врезультатеполучалидинамикузаписибазальныхзначенийимикроколебаний импеданса мочевого пузыря, а также базальных значений испонтанных колебаний внутрипузырного давления (Рисунок 5).Рисунок 5 — Пример записи колебаний импеданса мочевого пузыряи внутрипузырного давления у кроликаСпектральный анализ микроколебаний биоимпеданса позволяет получитьих амплитудный спектр, содержащий низкочастотный пик Майера М1,респираторный пик R1, регистрируемый на частоте дыхания, кардиальный пикС1, регистрируемый на частоте сердцебиения, а также последующие гармоникиэтих пиков меньшей амплитуды (Рисунок 6).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
