Диссертация (1154734), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Образцы буккальногоэпителия обычно дают малый выход ДНК и плохо переносят длительное хранение[126]. Таким образом, мы остановились на сборе слюны и крови в качествеисточникаДНК,взависимостиотсогласияпациента.Сравнительноеисследование выхода и качества ДНК из крови и слюны [126, 127] показывает,что несмотря на примерно вдвое меньший выход ДНК из слюны, этогодостаточно для генотипирования в 98% случаев, с качеством не менее 97% отнаблюдаемого при использовании ДНК материала, выделенного из крови. Вработе были использованы наборы для сбора слюны Affymetrix и Biomatrix.Традиционным методом исследования генотипов в данное время являетсяиспользование ДНК-чипов и секвенирования, которые позволяют быстрополучить данные о протяженных участках ДНК.
Такой метод является наиболееподходящим в случае поиска новых ДНК-вариантов, ответственных за развитиефенотипа, так как он позволяет единовременно тестировать сотни и тысячиполиморфизмов. В то же время, определяющим фактором является дороговизнатакого подхода. В случае, небольшого количества исследуемых полиморфизмовнаиболее эффективным является метод кПЦР (qPCR - Quantitative polymerasechain reaction) – ПЦР в реальном времени.Метод ПЦР в реальном времени основан на использовании флуоресцентныхпроб, специфичных к короткому участку ДНК, содержащему искомыйполиморфизм. В процессе удлинения продукта ПЦР, детектирование нуклеотидовпроизводится при активации генотип-специфичного флуорофора пробы, привзаимодействии с растущей цепью ДНК (рис.
3)44Рисунок3.СхемакПЦРвреальномвремени(https://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction). (1) Пробы доприсоединения к ДНК, флуоресценция пробы потушена (2) Проба связана скомплементарной цепью ДНК, флуоресценция пробы потушена. (3) В процессеамплификациипробадеградируетсяДНК-полимеразойивысвобождаетфлуоресцентный маркерВыделение ДНК из биоматериала и проведение кПЦР исследований проводилосьв сотрудничестве с компанией «Синтол» (г. Москва, ул. Тимирязевская 42).2.4.
Выделение геномной ДНКПолучение высококачественных образцов ДНК является ключевым шагом впроцессе идентификации генотипов. Во многих исследованиях предпочтениеотдается выделению материала из крови, несмотря на инвазивность и дороговизнупроцедуры. ДНК, полученная из образца крови, преимущественно используетсядля создания иммортализованых клеточных линий, как бесконечного источникаДНК.
Также возможно выделение индуцированных стволовых клеток дляфункциональных исследований. В то же время, в связи с более активнойфрагментацией ДНК, кровь имеет намного меньшее время хранения, чем слюна.Выделение ДНК из слюны является неинвазивным и намного более дешевымспособом получения материала для исследований.
Этот способ значительнонедооценен из-за устойчивого мнения о малом количестве доступного ДНКматериала. Однако, многочисленные исследования показывают, что при среднем45содержании в 4,3х105 клеток/мл, слюна является достаточным источникомбиоматериала для геномных тестов. Выделение ДНК включает в себя несколькошагов: 1) выделение и хранение, 2) лизис клеток, 3) обработка РНКазой, 4)осаждение белков, 5) осаждение с помощью этанола, 6) регидратация ДНК.Выделение ДНК проводилось в соответствие с протоколом:1) Выделение и хранение.1) Перед забором слюны, пациенты воздерживались от приема пищи ипитья в течение 30 минут.2) В пробирку для центрифугирования объемом 15 мл, содержащую 2,5 млстабилизирующего буферного раствора (на 250 мл буферного раствора: 1 МNaCl – 1,461 г, Tris HCl – 2,5 мл, 0,5 М ЭДТА – 5 мл, 10% SDS – 12,5 мл,раствор Протеиназы К (20 мг/мл) – 2,5 мл, ddH2O – 227,5 мл), собирали 2,5мл слюны.3)Пробирказакрываласьновойкрышкойиперемешиваласьдогомогенизации содержимого.
Образцы, слюны могут храниться до трехмесяцев при комнатной температуре, образцы для более длительногохранения помещались в холодильную камеру с температурой 4°С.2) Начальные приготовления и лизис клеток.1) Перед началом процедуры выделения, готовилась водяная баня (37°С),емкостьсольдом,триконическихпробирки(15мл)дляцентрифугирования. Три пробирки были необходимы для помещенияклеточныхибелковыхгранул,конечнойвыделеннойгДНКиизопропаноловых и этаноловых супернатантных жидкостей.2)Образцыслюнынесколькоразперемешивались,центрифугировались на средней скорости в течение 15 сек.затем463) 2,5 мл образца переносились в чистую 15 мл пробирку дляцентрифугирования, добавлялось 5 мл лизатного буферного раствора иперемешивалось 50 раз.
Затем, смесь инкубировалась 30 минут прикомнатной температуре.3) Удаление РНК.1) Добавлялось 40 мкл раствора РНКазы А (100 мг/мл) и инкубировалось 15мин при 37°С на водяной бане.2) Затем, образец перемещался на лед и охлаждался в течение 3 минут.4) Удаление белков и липидов.1) К полученному раствору добавлялось 50 мкл раствора протеиназы К (20мг/мл), раствор несколько раз перемешивался и инкубировался минимум 30минут при комнатной температуре.2) Добавлялось 1,7 мл белок-осаждающего раствора, полученный растворцентрифугировался на высокой скорости 20 секунд и помещался на лед на10 минут.3) После охлаждения, образец центрифугировался 10 минут на 3000оборотах, при температуре 4°С.
Осаждающиеся белки должнысформировать плотные гранулы для продолжения протокола.5) Выделение и очистка гДНК.1) В чистую пробирку для центрифугирования (15 мл) пипетировали 5 млизопропанола и 8 мкл чистого раствора гликогена (20 мг/мл).2) Супернатантную жидкость из шага 4.3 переносили в пробирку,содержащую изопропанол и раствор гликогена. После внесениясупернатантной жидкости, раствор аккуратно перемешивался 50 раз и затемцентрифугировался 30 минут при 3000 оборотах и 4°С.473) Полученная супернатантная жидкость переносилась в чистую 15 млпробирку. После удаления супернатантной жидкости, к оставшимсягранулам добавляли 1 мл 70% раствора этанола для промывки гранулосадка.4) После первичной промывки, образец центрифугировался 1 минуту при2000 оборотах и 20°С.5) Затем, этанол аккуратно удалялся и повторялись шаги 5.3, 5.4.6) После удаления супернатантной жидкости вторичной промывки,гранулам давали высохнуть на воздухе в течение 15 мин.6) Регидратация гДНК.1) После просушки образца добавлялось 300 мкл трис-ЭДТА длярегидратации гранул гДНК.2) Раствор перемешивался в течение 5 секунд и помещался в водяную баню(65°С) на 1 час.3) Затем образцы инкубировались при комнатной температуре.Выделение гДНК из образцов крови проводилось в соответствии с протоколом:1) Лимфоциты выделялись из крови при помощи лизиса эритроцитов сиспользованием гипотонического буферного раствора (бикарбонат аммония +хлорид аммония), который оказывает минимальный лизирующий эффект налимфоциты.
Три объема лизирующего буферного раствора добавлялись к образцукрови, тщательно перемешивались в течение 5 минут, затем центрифугировались10 минут при 20 g. Супернатантная жидкость удалялась почти полностью,оставляя около 1 мл, чтобы предотвратить потерю клеток.482) К осадку повторно добавлялось 3 объема лизирующего буферного раствора иповторялись шаги перемешивания и центрифугирования 2-3 раза до полученияпрозрачной супернатантной жидкости и белого осадка. После последнейпромывки, супернатант удалялся полностью.3) Осадок суспензировался в 500 мкл PBS, с последующим добавлением 400 мкллизирующего буферного раствора (10 мМ Tris-HCl, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl,10% SDS, pH 7.5) и 10 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Раствор перемешивался дополного растворения осадка и, затем, инкубировался на водяной бане (56°С) втечение двух часов.4) Равный объем фенола (стабилизированного Tris, pH 8), добавлялся к раствору иперемешивался в течение 1 минуты.
Затем раствор центрифугировался 10 минутпри 10000 g и температуре 4°С.5) Верхний водный слой переносился в новую пробирку, содержащую равныеобъемы фенола и смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1). Растворперемешивался 1 минуту и центрифугировался 10 минут при 10000 g и 4°С.Супернатант затем переносился в новую пробирку с добавлением 10 мкл (10мг/мл) раствора РНКазы А.6) Образец инкубировался при 37°С в течение 30 минут, затем добавлялся равныйобъем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1), перемешивался втечение 1 минуты и центрифугировался 10 минут при 10000 g и 4°С.7) Супернатант переносился в новую пробирку с добавлением двукратногообъема абсолютированого этанола. Образец перемешивался несколько раз иохлаждался при -20°С. Затем образец центрифугировали 20 минут при 10000 g и4°С.8) Супернатант удалялся, к осадку добавлялось 250 мкл 70% этанола.
Осадокосторожно уплотнялся и раствор центрифугировался 10 минут при 10000 g. Затем,супернатант аккуратно декантировался с осадка.499) Осадок сушился в ламинарном потоке воздуха. Высушенные гранулырастворялись в 50 мкл очищенной от нуклеаз воды или 1хТЕ буферном растворе ихранился при -20°С или -80°С.2.5. Методы статистического анализаПоиск аллельных ассоциацийАнализ часто встречающихся ДНК-вариантов (common variants), можетпроводится несколькими способами. Основной целью анализа является выявлениеразличия частоты аллелей в группах больных и контролей.
Начальная гипотеза(Н0) анализа заключается в том, что различий между генотипами в группах нет.Эмпирическая оценка значимости различия в частоте проводится путеммногочисленных перестановок меток «пациент» и «контроль» в массиве данных иотслеживанииколичестваперестановок,ведущихкотличномуотН0распределению частоты аллелей. Такой подход наиболее приемлем дляисследований, включающих сотни и тысячи образцов, так как требуетсуществования большого количества независимых перестановок.Альтернативным методом, подходящим для меньших по размеру групп,является точный тест Фишера.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
