Диссертация (1154734), страница 11
Текст из файла (страница 11)
The top SNP pairwise LD measures are highlighted in yellow. Of note isthe HLA Classthat is in long-range LD withthe NOTCH4 SNPs to the left.Genes are depictedat the top andthe correspondingSNPs areРисунок6.II SNPХарактеристиканеравновесногосцеплениямеждупятьюнаиболееbelow in the LD plot. Black triangles depict blocks of LD.ассоциированными с КВ полиморфизмами [8]have shown significant associations of NOTCH4 with systemicsclerosis, myeloperoxidase levels, age-related macular degeneration, asthma and schizophrenia.30,31 In addition, independently ofHLA genes, NOTCH4 polymorphisms have been associated withautoimmune disorders.32,33 The importance of Notch signaling inT-cell development makes it a viable candidate gene for MCvasculitis.
However, the SNPs that mark NOTCH4 and MHC class IIare too strongly correlated to discriminate the degree to whicheach region contributes to the association, and there is notractable experimental model of MC vasculitis that can be used toТаким образом, два наиболее ассоциированныхполиморфизма- rs2071286 иdissect the associationfurther.In summary, our GWAS data based on a large sample of MCvasculitisand controlsidentified twoотsignificantregionsrs9461776 являются слабо связанными другс patientsдругом,в отличиедругихwith implicated polymorphisms: MHC Class II and NOTCH4.However, we do not have evidence to indicate the causal variantsвозможных пар. Эти два полиморфизма быливыбраныдляfor theseassociations.Eachдальнейшегоof these genes may анализаplay a role butfurther investigation is needed to determine the biologic link tothis syndrome.генетических рисков в целевой группе пациентов.Отношение рисков дляGenes and Immunity (2014) 500 – 505& 2014 Macmillan Publishers Limitedrs2071286и rs9461776 составляет 2,15 и 2,16, соответственно.Сравнительнонебольшие отношения рисков объясняются малым давлением отбора, котороесвязано с ХГС и КГ (КВ), в частности.
В то же время, эффекты среды редкоимеют отношение рисков более 1,05, что позволяет сделать вывод о заметномвкладе генетических факторов в развитие КВ.Интересно проследить, что известно о каждом из группы генов,расположенных в ассоциированном регионе – NOTCH4, HLA-DRB1, HLA-DQA1.Функции гена NOTCH4 на данный момент неполно описаны в литературе.Известно, что ген является частью высоко консервативного NOTCH-каскадабелков, являющийся трансмембранным рецептором. Он участвует в передачепролиферативныхсигналовпринейрогенезеииграетважнуюрольвэмбриональном развитии [132].
Консервативная природа ДНК-вариабельности вгене NOTCH4 не сочетается со сравнительно высокой частотой заболевания КВ67(по разным оценкам 5-15%). В то же время, гены HLA-DRB1 и HLA-DQA1относятся к генам рецептора HLA-Class II, который присутствует в антигенпрезентующих клетках – дендритных клетках, мононуклеарных фагоцитах,некоторых эндотелиальных клетках, эпителиальных клетках вилочковой железы иB-лимфоцитах [133].
Эти типы клеток являются важнейшими участникамиинициации иммунного ответа. Таким образом, можно предположить, чтополиморфизмы рецептора HLA-Class II являются ассоциированными с КГ и КВ.Известно, что специфические аллели генов иммунной системы имеютбольшое влияние на манифестацию аутоиммунных и инфекционных заболеваний.Так, например, пациенты с аллелями HLA-B27 (HLA-Class I) при заболеваниивирусомиммунодефицитадемонстрируютзначительноболеемедленныйпрогресс к развитию СПИДа.Таким образом, можно выдвинуть гипотезу о том, что в зависимости от типааллелей HLA-Class II у пациента можно ожидать бессимптомное течение КГ либоманифестация КВ.
Для проверки такой гипотезы требуется типирование HLA угруппы исследуемых пациентов и группы контролей. Однако, процедура точногоэкспериментального типирования HLA требует значительных средств и наданный момент для пациентов с КВ и КГ не была проведена ни однойисследовательской группой в мире.3.2.2. Анализ взаимосвязи вариантных аллелей исследованных генов сразвитием криоглобулинемии и криоглобулинемического васкулитаС помощью метода ПЦР в реальном времени были получены данные огенотипах в группе пациентов и контролей для двух выбранных полиморфизмов.Генотипы, отличные от референсных определялись методом электрофорезнойдетекции (рис. 7).68Рисунок 7.
Пример результатов кПЦР детекции генотипов. Вертикальнаячерта показывает положение искомого полиморфизма на диаграмме. Надиаграмме детекции для искомого полиморфизма присутствуют два пика,соответствующиенуклеотидамAиG.Вданномотношениерисковслучаенаблюдаетсядляисследуемыхгетерозиготный генотипСравнительнополиморфизмовнебольшоетребуетзначительнойстатистическоймощностидляобнаружения значимого эффекта.
Эта проблема в литературе имеет двавозможных решения. Первое - тщательный отбор пациентов для включения висследуемуюгруппу.Приисключениивозможногостороннеговлияниякоинфекции и аутоиммуных заболеваний на развитие КГ - больше шансов, чтовозникновениеHCV-ассоциированныхКГиКВвызваногенетическойпредрасположенностью.
Второе – использование больших выборок генотипов,чтобы повысить статистическую мощность используемых критериев сравнения.Зачастую, второй подход является дорогостоящим и не всегда доступным длябольшинства лабораторий.В нашей работе мы совместили два предложенных решения. Во-первых, мыиспользовали более строгие критерии отбора пациентов и группы контролей, чемв ранее представленных исследованиях, где ХГС сопутствовали другие инфекции69и аутоиммунные заболевания, способные вызывать КГ.
Во-вторых, в качестведополнительной группы контролей мы использовали базу данных gnomAD(gnomad.broadinstitute.org).GnomAD (Genome aggregation database) – специализированный ресурс,разработанный с целью согласования данных экзомного и полногеномногосеквенирования. База данных, собранная из множества проектов, предоставляетстатистические данные о генотипах. Набор данных включает в себя более 120тысяч экзомных и более 15 тысяч полногеномных сиквенсов разных народностей.В качестве популяционных контролей мы использовали данные 7266 человекевропейской популяции. При этом, финская популяция была исключена из-заизвестного феномена обнаружения высокого процента гомозиготных мутаций вданной группе.
Среди доступных данных в базе gnomAD нет результатовтестирования на КГ. Однако, в виду большого размера группы, мы предположили,что генетический риск развития КВ и КГ должен соответствовать среднему дляевропейской популяции. Также при таком подходе отношение рисков в целевойгруппе пациентов с КВ и КГ при сравнении с популяционными контролями будетнедооценено. Недооценка в данном случае, является приемлемой, так как невносит ложно положительного сигнала ассоциации.Данные по генотипам для групп пациентов с КВ, БСКГ, группысоответствующих контролей и группы популяционных контролей (gnomAD)представлены в таблице 10.70Таблица 10Обзор генотипов в группах пациентов, контролей и популяционныхконтролей (gnomAD)ДНК-полиморфизмrs2071286rs9461776Ген-кандидатNOTCH4HLA Class IIГенотипировано пациентов в группе КВ3131Генотипировано пациентов в группе БСКГ2323Количество аллелей риска в группе КВ2112Количество аллелей риска в группе БСКГ1815Суммарное количество аллелей риска3927Генотипировано контролей2626Количество аллелей риска в группе контроля73Генотипировано популяционных контролей72667265Количество аллелей риска в группепопуляционных контролей (gnomAD)34341414Мы использовали точный тест Фишера для сравнения отдельных групппациентов и контролей по каждому из полиморфизмов.
Остается неизученнымвопрос о причинах формирования КВ только лишь у части больных с КГ (1015%). Поэтому, на первом этапе мы сравнили частоты риск-ассоциированныхаллелей в группе больных БСКГ и КВ. Мы не обнаружили статистическогоразличия между двумя группами, как в случае rs2071286 (р=0,83; ОР=0,87;доверительный интервал = 0,35-2,15), так и в случае rs9461776 (р=0,35; ОР=0,6;доверительный интервал = 0,21-1,66). Что свидетельствует о сходной величинегенетического риска развития КВ у пациентов с БСКГ по сравнению с группойпациентов с уже диагностированным КВ.
Таким образом, мы объединили двегруппы исследуемых пациентов в одну для дальнейшего анализа.Мы провели сравнение частот риск-ассоциированных аллелей в двух ДНКполиморфизмах в группах пациентов и контролей. Получено статистическизначимое различие для маркера rs9461776 (р=0,017; ОР=4,29; доверительный71интервал = 1,15-24,07) и близкое к значимому различие для маркера rs2071286(р=0,037; ОР=2,66; доверительный интервал = 0,99-8,02). Статистическаязначимость, в данном случае определяется поправкой Бонферрони длятестирования многочисленных гипотез. Нулевая статистическая гипотеза длякаждого полиморфизма, в данном случае, формулируется, как отсутствие разницыв частоте, с которой риск-ассоциированные аллели встречаются в группепациентов и группе контролей.
Альтернативная гипотеза принимается сдопустимой вероятностью ошибки в 5%. Однако, поправка Бонферрониучитывает увеличение вероятности ошибки при тестировании несколькихгипотез. Для этого, принятие отдельной альтернативной гипотезы допускается свероятностью ошибки равной 0,05/N, где N – количество тестируемыхнезависимых гипотез. В случае тестирования двух ДНК-полиморфизмов поправкаБонферрони устанавливает статистическую значимость результата при р<0,025.Сравнение частот риск-ассоциированных аллелей в исследуемых группах0.20.40.60.8КВБСКГКонтрольСреднее в популяции0.0Частота риск-ассоциированных аллелей1.0представлено на рисунке 8.rs2071286rs9461776Рисунок 8. Частоты риск-ассоциированных аллелей в исследуемых ДНК-маркерах72Совместный стратифицированный анализ группы пациентов против двухгрупп контроля (нашей контрольной группы и группы популяционных контролей)с помощью теста Кохран-Мантель-Ханцель (Cochran-Mantel-Haenszel) показываетвысокую, статистически значимую степень ассоциации обоих ДНК-маркеров(р=0,0073;ОР=1,7ир=3,8х10-6;ОР=2,82дляrs2071286иrs9461776,соответственно).
Полиморфизм rs2071286, имеет большую частоту в популяции,нежели rs9461776, и при увеличении выборки достигает статистически значимойассоциации. Сводная статистика тестов генетической ассоциации представлена втаблице 11.Таблица 11Сводная статистика тестов генетических ассоциацийДНК-полиморфизмКВ+БСКГ против группыконтролей с ХГСКВ+БСКГ против группыпопуляционных контролейrs2071286rs9461776р=0,037 (ОР=2,66)р=0,017 (ОР=4,28)р=0,045 (ОР=1,52)р=2,1х10-4 (ОР=2,57)р=7,3х10-3 (ОР=1.70)р=3,79х10-6 (ОР=2,82)Стратифицированныйанализ КВ+БСКГ противдвух контрольных группПолученные ассоциации подтверждают со-направленность генетическихрисковупациентовзападноевропейскихисследованийиупациентов,наблюдаемых в клинике им. Е.М.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
