Диссертация (1154718), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Для оценки влияния полиморфизмов на39частоту ВТЭО, в числе последних учитывались как имевшие клиническуюсимптоматику, так и выявленные при скрининге.2.2 Методика генетического исследования2.2.1 Выделение ДНКЗабор венозной крови в объеме 5 мл проводили в пробирки, содержащиеЭДТА в качестве антикоагулянта (1 объем раствора 0,5 М Na2- ЭДТА, рН 8,0+ 9 объемов крови). Образцы тщательно перемешивали, затем хранили при 700С в морозильной камере.Выделение геномной ДНК проводили из периферической венознойкрови, стабилизированной ЭДТА, с помощью коммерческого набора QIAmpDNA Blood Mini Kit и автоматической станции QIAcubeTM (QIAGEN).
Вприбор QIAcubeTM помещали 200 мкл образцов крови в пробирках объемом2 мл, комплект адапторов с колонками и 1,5 мл пробирками, наконечники, инеобходимыереагенты(QIAGEN),послечегозапускалиавтоматизированный протокол для выделения ДНК из крови с объемомэлюции раствора ДНК 100 мкл. Для лизиса к образцам крови добавлялось 20мкл свободной от ДНКаз протеазы QUAGEN (или протеиназа К) и 200 мклбуфера AL, полученная смесь перемешивалась и инкубировалась при 56оС втечение 10 минут.
Далее в пробирки добавлялось 200 мкл 96% этиловогоспирта с последующим перемешиванием на встроенном в прибор шейкере.Для связывания ДНК с сорбентом весь объем полученной смеси переносилсяв колонки и центрифугировался в течение 1 минуты при 6000g. Фильтратоказывался на дне адаптера, в который изначально была помещена колонка.Далее автоматически последовательно проводилось 2 шага промывкиколонок буферами AW1 и AW2 объемом 500 мкл с центрифугированием втечение 1 и 3 минут при 6000g и 20000g соответственно. Промытая колонкапереносилась прибором в отдельную чистую пробирку, после чего ДНКэлюировали с сорбента колонки добавлением 100 мкл буфера AE и40инкубацией при комнатной температуре в течение 1 мин с последующимцентрифугированием при 6000g в течение 1 минуты.
Для полученияотрицательногоконтролявсешагивыделенияпроходилрастворантикоагулянта ЭДТА из пробирок для забора крови.Концентрацию ДНК определяли по поглощению раствора ДНК придлине волны 260 нм (А260) с помощью прибора NanoDrop200. Чистота ДНКопределялась по соотношению поглощений при 260 и 280 нм соответственно(А260/А280). Полученное отношение находилось в пределах 1,7-1,9, чтосвидетельствовалооботсутствииконтаминации.ВыделеннаяДНКпомещалась в морозильную камеру и хранилась при -200С до проведенияПЦР.2.2.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)Определение полиморфизма исследуемых генов проводили методомполимеразнойцепнойреакциисдетекциейрезультатовврежиме«реального» времени и анализом кривых плавления с использованиемкоммерческих наборов реагентов фирмы ДНК-технология на детектирующемамплификаторе DTprime (ООО «ДНК-технология») согласно методике,описанной в инструкции по применению к наборам.
Технология ПЦР санализом кривых плавления дает возможность идентифицировать фрагментыДНК путем детекции изменений в уровне флуоресценции комплексафрагмент–проба (меченный флуорофором олигонуклеотидный зонд) на этапеего денатурации и последующего построения графика кривой плавления. Дляопределения нуклеотидной последовательности, образовавшейся в процессеамплификации, используется метод примыкающих проб (kissing probes илирезонансный перенос энергии). В его основе лежит использование двухтипов олигонуклеотидов (проб), гибридизующихся на матрицу при низкойтемпературе в непосредственной близости друг от друга.
Один изолигонуклеотидов метят флуоресцентным донором, другой – акцептором(гасителем). Идентификация нуклеотидной последовательности образца41осуществляется в процессе плавления дуплексов (результат гибридизациифрагментов ДНК и олигонуклеотидных зондов), который происходит припоследовательном увеличениитемпературыреакционнойсмеси.Преимуществом данного подхода является использование специфическихфлуорофоров, снижающих риск детектирования неспецифических продуктовамплификации, как при использовании интеркалирующих красителей.
Дляисключения ошибок генотипирования и оценки качества выделенной ДНКпри получении результатов учитываются данные внутреннего контроля.2.3 Статистический анализ данныхСцельюстатистическойобработкиполученныхданныхиспользовались программы StatSoft Statistica 10.0, IBM SPSS 18, MedCalc17.2. Проверка нормальности распределений производилась по методамКолмогорова-Смирнова либо Шапиро-Уилка в зависимости от размероввыборок. Для сравнения частот номинальных показателей между двумягруппами применялся точный тест Фишера, между тремя группами – хиквадрат Пирсона. Для сравнения двух групп по количественным признакамприменялся U-критерий Манна-Уитни, трех групп – критерий КраскеллаУоллеса.
Показатель отношения шансов (ОШ) расценивался как отношениевероятностиналичиясобытиякегоотсутствию.ЗначимостьОШпризнавалась в тех случаях, когда 95% доверительный интервал не включалединицу. Был принят уровень значимости для оцениваемых гипотез равный<0.05. Для определения значимости предикторов ВТЭО применяласьлогистическаярегрессия, диагностическаяэффективность полученныхинтегральных показателей оценивалась с помощью анализа ROC-кривых сприменением коэффициента Юдена.42ГЛАВА 3.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ3.1 Скрининг бессимптомных ТГВ у пациентов с ААВ и в общейпопуляции3.1.1БессимптомныеТГВвгруппепациентовсАНЦА-ассоциированными васкулитами и в контрольной группе.С целью скрининга бессимптомных ТГВ в случайной выборке из 514обследованных без системной патологии, и у 99 из 377 всех больных АНЦАассоциированнымиваскулитамипроводиласьУЗДГвеннижнихконечностей. Бессимптомные дистальные ТГВ были обнаружены у 8/99пациентов (8,1%) с АНЦА-ассоциированными васкулитами, в том числе у3/76 (4,1%) – с ГПА, 3/13 (23,1%) – с МПА и 2/14 (14,3%) – с ЭГПА. Частотабессимптомных ТГВ была выше у пациентов с признаками активностиваскулита и составила 12,5% (8/64).
Увеличение частоты ТГВ при активностиваскулита было сходным у пациентов с ГПА (3/45 , 6,7%), МПА (3/9 33,3%),и ЭГПА (2/10 , 20,0%).У 6 из 8 пациентов бессимптомный дистальный ТГВ был выявлен втечение 6 месяцев после установления диагноза васкулита, тогда как у 2других пациентов – через 14 и 92 месяцев после установления диагноза,однако в период активности васкулита. Все пациенты с бессимптомнымидистальными ТГВ соответствовали низкому риску ТГВ по шкале Padua (1-2балла).
В контрольной группе наблюдали 2 (0,4%) случая бессимптомногодистального ТГВ у 514 пациентов (ОШ, стандартизованное по полу ивозрасту, – 22,5; 95% ДИ 4,7-107,7). Количество пациентов с МПА и ЭГПАбыло небольшим, поэтому доверительные интервал ОШ были широкими.Тем не менее, увеличение частоты ТГВ по сравнению с контролем былостатистически значимым у больных со всеми АНЦА-ассоциированнымиваскулитами, так как ДИ не включал 1,0.
(рисунок 6).43Рисунок 6. Отношения шансов (ОШ) для ТГВ у пациентов с АНЦАассоциированными васкулитами при сравнении с контрольной группой3.1.2 Характеристики обследованной когорты пациентов сААВУ 64 (64,9%) на момент выполнения исследования отмечаласьактивность васкулита, (индекс BVAS≥1).
Все 99 пациентов получалиглюкокортикостероиды (ГКС), 76 (78,4%) – циклофосфамид (ЦФА), 18(18,9%) – ритуксимаб. У 8 (8,1%) суммарный балл по PPS составил ≥4, чтосоответствовало высокому риску ВТЭО. (табл. 2)Таблица 2.Клинико-демографические характеристики пациентов, которымвыполнялась УЗДГ вен нижних конечностейМужской пол, n(%)Возраст, лет**Поражение почек,n(%)Поражение легких,n(%)МПО-АНЦА, n(%)ПР3-АНЦА, n(%)АНЦА-негативные,n(%)Время от диагноза доУЗДГ, мес,**≤6 месяцев, n(%)>6 месяцев, n(%)Всепациенты(n=99)32 (32,3%)54,0(48,0;64,0)55 (57,3%)ГПА (n=72)МПА(n=13)ЭГПА(n=14)р23 (31,9%)54,0(48,0;64,0)36 (50,7%)4 (30,8%)57,0(39,0;62,0)13 (100%)5 (35,7%)54,0(50,0;65,5)6 (50%)0,955*0,946**68 (70,1%)45 (63,4%)10 (76,9%)13 (100%)0,025*18 (18,4%)56 (57,1%)21 (21,9%)7 (9,9%)49 (69,0%)12 (16,9%)7 (53,8%)6 (46,2%)0 (0%)4 (28,6%)1 (7,1%)9 (69,2%)0,001*0,001*0,001*59,5(26,5;104,3)9 (9,1%)90 (90,9%)66,5(31,8;122,8)5 (6,9%)67 (93,1%)24,0(14,0;76,0)2 (15,4%)11 (84,6%)52,0(14,5;82,5)2 (14,3%)12 (85,7%)0,106**0,004*0,477*44Продолжение таблицы 2.BVAS ≥1, n(%)ГКС, n(%)ЦФА, n(%)Ритуксимаб, n(%)PPS1-3, n(%)≥4, n(%)64 (64,6%)99 (100%)76 (78,4%)18 (18,9%)45 (62,5%)72 (100%)59 (81,9%)13 (18,3%)9 (69,2%)13 (100%)10 (76,9%)3 (25,0%)10 (71,4%)14 (100%)7 (58,3%)2 (16,7%)0,761*1,000*0,183*0,847*91 (8,1%)8 (91,9%)68 (94,4%)4 (5,6%)11 (84,6%)2 (15,4%)12 (85,7%)2 (14,3%)0,320*Значения р определены для : * - хи-квадрата Пирсона , ** - КритерияКраскелла-Уоллеса (приведенные значения показаталей – медиана (нижняяквартиль, верхняя квартиль)3.1.3 Сравнение пациентов с АНЦА-васкулитами с бессимптомнымидистальными ТГВ и без ТГВГруппы пациентов с ТГВ (n=8) и без ТГВ (n=91) был сопоставимы посреднему возрасту и ИМТ.
Доля мужчин была выше среди пациентов с ТГВ,однако разница не достигла статистически значимой. Период времени,прошедшего от момента установления диагноза до выполнения УЗДГ, былстатистически значимо более коротким у пациентов с ТГВ (4,0 (2,5;18,8)против 63,5 (32,0;120,5) месяцев , р < 0,001). Кроме этого, в этой же группебыла значимо меньшей кумулятивная доза циклофосфамида. Активностьваскулита статистически значимо чаще отмечалась в группе пациентов с ТГВ(100% против 61,5%, р=0,029), тогда как частота традиционных факторовриска (например, ожирение, пожилой возраст, сахарный диабет, ТГВ ванамнезе) достоверно не отличалась между группами.
Следует отметить, чтоВТЭО в анамнезе отсутствовали у всех пациентов с бессимптомным ТГВ иимелись у 8,8% больных без ТГВ. Отмечалась тенденция к статистическойзначимости в различиях по медиане уровне АНЦА: 20,4 МЕ/мл в группе сбессимптомными ТГВ против 2,2 МЕ/мл в группе без ТГВ (таблица 3).45Таблица 3.Характеристики пациентов с бессимптомными ТГВ и без ТГВ намомент выполнения УЗДГБессимптомныеБезТГВ (n=8)бессимптомныхpТГВ (n=91)Мужчины, n (%)4 (50,0%)Возраст, лет**28 (28,3%)0,265*53,5 (49,8;63,8)54,5 (47,5;64,0)0,760**ИМТ, кг/м226,2 (22,9;29,3)26,7 (24,0;30,8)0,650*Активный васкулит, n(%)8 (100,0%)56 (61,5%)0,029*63,5 (32,0;120,5)<0,001**4 (4,4%)<0,001*2,2 (0,8;4,8)0,089**Время от диагноза до УЗДГМедиана, месс,4,0 (2,5;18,8)≤6 мес,5 (62,5%)Уровень АНЦА, ME/мл20,4 (2,3;123,7)Доза ЦФА, г**3,8 (2,2;29,1)33,6 (7,8;78,0)0,062**Доза ГКС, мг**40,0 (23,8;48,8)6,25 (55,0;11,3)0,611**Значения р определены для : * - двустороннего теста Фишера , ** - Uкритерия Манна-Уитни (приведенные значения показателей – медиана(нижняя квартиль, верхняя квартиль)Всем8пациентамсТГВназначалиантикоагулянты(низкомолекулярныегепарины/варфаринилиривароксабан).2из8пациентов выпали из наблюдения, для остальных его период составил всреднем 12,2 (3,0;21,0) месяцев.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
