Диссертация (1154712), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Измеряли толщинубелочной оболочки семенника, толщину соединительнотканной пластинысемявыносящего протока и его эпителия. Измерение величин проводилось впрограмме Image Scope M.43Для определения коллагенов в соединительнотканной капсуле вокругнитей эндопротезов производили окраску гистологических срезов Sirius red снабором реактивов (Picro Sirius Red Stain Kit, connective tissue stai). Окраскавключала следующие процедуры: срезы 5 мкм погружались в раствор PicroSirius на 30 мин (0,1% раствор Sirius Red F3BA c пикриновой кислотой рН 2),затем промывались в 0,01 N HCl 2 мин, дегидратировались и заключались всинтетическую заливочную среду Bio-Mount (Bio Optica Milano S.P.A.,Италия).Визуализацию коллагена I и III- типов осуществляли в поляризационномсвете при увеличении х400 в области 0,1 мм2 вокруг нитей сетчатогоэндопротеза (в среднем по 3 исследования на каждую зону).
Исследовалисьцветные гистограммы распределения процентов красных, зеленых и синихпикселей. В каждом случае подсчитывалось соотношение красных и зеленыхпикселей, что соответствовало распределению коллагена I и III- типов.Измерения выполняли в программе ImajeJ 1.46 (Wayne Rasband, NationalInstitute of Health, США).2.2.2 Иммуногистохимический методС помощью данного метода изучалась пролиферативная активностьклеток в зоне контакта нитей сетчатого эндопротеза с окружающими тканями.Из блоков, приготовленных для гистологического исследования, намикротоме нарезали серийные срезы толщиной 5 мкм и монтировали настекла, покрытые поли-L-лизином.
Депарафинизациюи восстановлениеантигенной активности срезов осуществляли в PT модуле при температуре+980С в течение 20 минут. Дальнейшие процедуры осуществлялись вавтоматическом режиме на Autostainer 360 с использованием системывизуализации QUANTO.Для определения степени пролиферативной активности на срезынаносили 100 мкл моноклональных кроличьих антител к Ki-67, в качествевторичных антител использовали конъюгированную с пероксидазой хрена44ослинуюсыворотку,иммунизированнуюпротивкроличьихантител(EPITOMICS). После инкубации срезы отмывали в дистиллированной воде, азатем в течение 3 минут докрашивали гематоксилином Майера. После того,как срезы приобретали голубой оттенок, стекла извлекали, обезвоживали вбатарее спиртов восходящей концентрации, заключали в Bio-Mount (BioOptica Milano S.P.A., Италия).
Препараты исследовали под микроскопом (KarlZeiss). Для оценки пролиферативной активности клетокпроцентокрашенныхдиаминобензидиномвподсчитывалсякоричневыйцветядерпролиферирующих клеток к общему количеству ядер в области контактанитей сетчатых эндопротезов с окружающими тканями.2.2.3 Иммунологический методОценку протективной активности В-системы иммунитета производилипри помощи тест-системы для экспресс-диагностики латентнотекущих иклиническивыраженныхформиммунологическойнедостаточности,разработанной в ИБХ РАН (Патент РФ №2196333).Принцип диагностики базируется на определении уровня и качества(авидности) постоянно присутствующих в сыворотке крови нормальныхиммуноглобулиновGкполисахаридамипептидгликанамграмотрицательных, грамположительных и грамвариабельных бактерий, чтопозволяет судить о спектре супрессии иммунной системы. В нормесодержание высокоавидных антител составляет 75-100%, низкоавидныхсоответственно0-25%.Повышениеуровнянизкоавидныхантител,неспособных к выполнению эффекторных функций, приводит к снижениюэффективности иммунного ответа и развитию иммунопатологическихпроцессов (Патент РФ № 2191385).Технология дифференциации антител по авидности основана наструктурно-функциональных различиях между высоко- и низкоавиднымиантителами и их способности к трансформации из одного функциональногосостояния в другое in vivo / in vitro в результате модуляции четвертичнойструктуры молекулы под действием различных факторов физической,45химической, биологической природы.
На основании изменения структурных(индекс SH группы), функциональных,рассчитываетсяпротективных свойств антителиндекс модулирующего воздействия, который в нормесоответствует единице, и чем он ниже,тем выраженнее супрессияпротективной активности В-системы иммунитета (Патент РФ № 2240843).Материалом исследования являлась нормальная сыворотка кровиживотных, взятая до операции и после операций на 7, 14, 30 и 90 сутки.Для получения сыворотки свежесобранная венозная кровь в объеме 0,5мл выдерживалась в течении 30 минут при комнатной температуре, затем при+4 °С до полного образования фибринового сгустка.
Сыворотку отделялицентрифугированием при относительной центробежной силе RCF от 1000 до1200 xg (максимально до 1500 xg) в течение 10 минут, сохраняли при 4oC илипри -20oC в случае необходимости отдаленных тестирований.Для определения уровня и качества секретируемых иммуноглобулиновG был использован микрометод РПГА (реакция пассивной гемагглютинации),модифицированный для одновременного выявления высоко- и низкоавидныхантител.
Выбор метода продиктован необходимостью сохранения нативнойпространственной структуры белка, обусловливающей специфическуюбиологическую функцию антитела.Реакцию ставили в 96-ти луночном круглодонном полистироловомпланшете (Deltalab) с параллельным определением титров антител внормальной и подвергшейся модуляции сыворотке. Каждую сывороткуисследовали не менее чем в 8 разведениях, начиная с 1:10. Для постановкиреакции во все исследуемые лунки вносили по 0,025 мл 0,9% забуференногораствора натрия хлорида (рН 7,2).
В первые лунки двух близлежащих рядовдобавляли по 0,025 мл нативной и трансформированной сыворотки. Послекратной раститровки в лунки вводили по 0,025 мл 1%-ой взвесиформалинизированныхэритроцитовбарана,сенсибилизированныхантигенами грам +/- бактерий. За развитием реакции агглютинации наблюдалив течение 2 часов при комнатной температуре.46Учитывая, что данный тест не использовался с целью специфическойдиагностики, титром антител считалось последнее разведение сыворотки,которое дает агглютинацию. Предварительно проводился контроль наотсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов в буфере для титрования ив сыворотках агглютининов к эритроцитам барана.Процентное содержание высокоавидных антител (Сва) определяли поформуле:Сва% = Тва*100/Тобщ = Тва*100/( Тва+Тна), %;где:Тва – титр высокоавидных антител, определяемый в нативнойнормальной сыворотке;Тна–титрнизкоавидныхантител,трансформированныхввысокоавидное состояние, определяемый в нормальной сыворотке послемодулирующего воздействия.2.2.4 Статистическая обработкаСтатистическую обработку полученных результатов проводили наперсональном компьютере Dell Inspiron Core i7 в среде Microsoft Windows 8 впрограмме Statistica 8.
0 .Статистические данные приведены как M ± m, где М — выборочноесреднее значение, m — граница доверительного интервала для среднего.Достоверность значимых различий для нормально распределенныхпризнаков оценивали с помощью рангового критерия Манна—Уитни. Приэтом различия между группами данных считались статистически значимымипри p<0,05.С учетом уменьшения численности подопытных животных с каждымконтрольным сроком, была проведена проверка статистической однородностигрупп, показавшая, что все группы животных могут быть отнесены к однойгенеральной совокупности и обладают одинаковыми статистическимихарактеристиками47Глава 3Результаты исследований3.1 Имплантация полипропиленового и титанизированногополипропиленового сетчатых эндопротезов в мягкие тканиИмплантация сетчатых эндопротезов в мягкие ткани сопровождаетсяразвитием комплексной реакции организма, включающей в себя как местнуюреакцию воспаления, так и системную, связанную с активацией биосинтезаантител.3.1.1 Реакция мягких тканейПроведенноеморфологическоеисследованиеокрашенныхгематоксилином и эозином гистологических препаратов показало, что на 7суткипослеоперациивокругнитейполипропиленового(ПП)ититанизированного полипропиленового (ТПП) эндопротезов развиваетсягранулема, состоящая из макрофагов, лимфоцитов, гигантских клетокинородныхфибробласты,тел.Определяютсяединичныеконцентрическифиброциты.ориентированныеФибрилярныекомпонентысоединительной ткани выражены слабо.
К 14 суткам послеоперационногопериода гранулематозное воспаление сохраняется. Через 30 суток вокругнитейэндопротезовколичествокоторыхопределяютсясоединительнотканныепрогрессивноувеличиваетсякволокна,90суткампослеоперационного периода. Во всех препаратах на 30 и 90 сутки вокругнитей эндопротезов определяются гигантские клетки инородных тел, чтосвидетельствует о наличии хронического воспаления в зоне имплантации.Таким образом, при изучении препаратов, окрашенных гематоксилиноми эозином значительных отличий в реакциях мягких тканей на имплантациюПП и ТПП эндопротезов отмечено не было.
В обеих группах наблюдалосьразвитиегранулематозноговоспаленияиформированиесоединительнотканной капсулы вокруг нитей сетчатых эндопротезов.Как известно, соединительнотканная капсула формируется за счет48пролиферативной активности клеток воспаления, которая, в частности,предопределяется материалом, из которого изготовлен эндопротез. Видимо,существует зависимость между воспалительным процессом и формированиемсоединительной ткани вокруг нитей эндопротеза.Содержание пролиферирующих клеток в гранулемах вокруг нитейсетчатых эндопротезов на 7,30 и 90 сутки после имплантации оценивали припомощи иммуногистохимической (ИГХ) реакции моноклональных антител кбелку Ki-67.Через7сутокпослеимплантацииколичественныйанализпролиферативной активности клеток в гранулемах показал 29,1+5,7%пролиферирующих клеток вокруг нитей эндопротезов из полипропилена,33,6+3,1% - вокруг нитей эндопротезов из титанизированного полипропилена(р<0,05).
( табл.3; рис.3 А,Б)АБРис. 3. Сетчатый эндопротез, 7-е сутки после имплантации: А- ПП эндопротез, Б – ТПП эндопротез.ИГХ реакция с антителами к белку Ki-67. Окраска ДАБ-гематоксилин Майера (х400). Н-нитьсетчатого эндопротеза; П – ядра пролиферирующих клетокЧерез 30 суток после имплантации пролиферативная активность клетоквгранулемахвокругнитейППэндопротезасоставила15,9+4,3%пролиферирующих клеток и 26,9+3,6% - в гранулемах вокруг нитей ТППэндопротеза (р<0,05) (табл.3; рис.4 А,Б).49При сравнении результатов исследования, на 7-е и 30-е суткипослеоперационного периода количество пролиферирующих клеток вгранулемах вокруг нитей ПП эндопротеза достоверно снижается с 29,1+5,7%до 15,9+4,3% ( р<0,05).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
