Диссертация (1154497), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Содержание MDA также оценивали спектрофотометрически. Данный методоснован на том, что при взаимодействии MDA с двумя молекуламитиобарбитуровой кислоты при нагревании образуется окрашенный триметиновыйкомплекс с максимумом поглощения при 532 нм. Для этого к 0,02 мл исследуемойпробы добавляли 0,5 мл смеси тиобарбитуровой и уксусной кислоты всоотношении 1:1, затем инкубировали 60 минут при температуре 100оС.Измерения проводили с использованием спектрофотометра «Apel 330 PD»(Япония), результат сравнивали с контролем.
Количество MDA рассчитывали спомощью наборов «ТБК-Агат». Результаты выражали в мкмоль/г ткани вколоноцитах и мкмоль/л в плазме крови [Гаврилов В.Б., 1983; Кушманова О.Д.,1983; Строев В.А., 1986; Дерюгина А.В., 2010; Некрасов Э.В., 2012].2.4 Статистическая обработка полученных данныхСтатистическуюобработкуданныхпроводилисиспользованиеманалитического пакета приложения Excel Office 2010 с применением библиотеки46статистических функций, лицензией на право использования которого обладаетФГБОУ ВО КГМУ Минздрава РФ.
Проверку распределения данных насоответствие нормальному закону распределения осуществляли с помощьюкритерия согласия распределения Колмогорова-Смирнова. При соответствииэмпирического распределения нормальному теоретическому распределениюкритический уровень статистической значимости (p) принимали равным 0,05. Дляописания количественных признаков использовали параметры нормальногораспределения: среднее значение (M), стандартная ошибка среднего значения(±m), стандартное отклонение (s).
Для оценки значимости различий двух группнезависимых наблюдений использовали параметрический критерий – t-критерийСтьюдентапоследополнительнойпроверкиравенствадисперсийдвухсравниваемых групп посредством F-критерия Фишера – Снедекора. Для оценкивзаимосвязей исследуемых показателей использовали методы многомернойстатистики: КА, КЛА и ДА. Проверку наличия взаимосвязи между изучаемымипеременными осуществляли с использованием КА методом Пирсона. Дляразделения данных на группы однородности и оценки надежности и точностивыводов, сделанных на основании ограниченного статистического материала, вКЛА использовали иерархическую агломеративную процедуру с объединениемданных в кластеры по правилу одиночной связи, в качестве метрики использоваливеличину, обратную коэффициенту корреляции Пирсона.
При оценке результатовКЛАнадендрограммахучитываютсятолькостатистическизначимыевзаимосвязи при р<0,05 (обозначены дополнительной обводкой выделеннойобласти). В ДА для выбора значимых переменных использовали пошаговыйметод с исключением, основанный на использовании уровня значимости Fстатистики [Колемаев В.А., 1991; Реброва О.Ю., 2006; Буреева Н.Н., 2007;Мешалкина Ю.Л., 2008; Стукач О.В., 2011].47Результаты собственных исследованийГлава 3. Влияние гентамицина на микробиоценоз толстой кишки ибиохимические показатели сыворотки крови и колоноцитов мышей3.1 Микробный состав мукозной микробиоты толстой кишки в условияхэкспериментального дисбиозаНа начальном этапе исследования осуществляли изучение качественного иколичественного состава мукозной микробиоты ТК контрольной группы мышей.По результатам исследования установлено, что в составе мукозной микробиотыдоминировалиBifidobacteriumspp.lgКОЕ=(8,10±1,05),E.coli(lac«+»)lgКОЕ=(6,58±0,75) и Lactobacillus spp.
lgКОЕ=(6,48±0,66). Кроме того, вмуциновом слое ТК были идентифицированы представители рода SalmonellalgКОЕ=(5,07±0,63), бактерии родов Enterococcus lgКОЕ=(3,85±0,90) и CitrobacterlgКОЕ=(3,74±0,72), E.coli (lac«-») lgКОЕ=(3,48±0,57) и бактерии рода EnterobacterlgКОЕ=(3,01±0,47). Несколько ниже была численность Staphylococcus spp.(коагулазоотрицательных)lgКОЕ=(2,54±0,67),грибовродаCandidalgКОЕ=(2,38±0,49) и бактерий рода Streptococcus lgКОЕ=(2,14±0,55). Следуетотметить, что в составе мукозной микробиоты в контроле не выявленыStaphylococcus aureus и микроорганизмы рода Proteus (таблица 2).Следующим этапом исследования явилось определение качественного иколичественногомоделированииассоциированныйсоставапристеночнойэкспериментальногоДБТКДБ.микробиотыТКЭкспериментальныйхарактеризовалсяуменьшениеммышейпригентамицинчисленностидоминантных представителей микробиоты, так содержание E.coli (lac«+»)снизилось в 2,1 раза (р≤0,001), Lactobacillus spp.
– в 1,8 раза (р≤0,05),Bifidobacterium spp. – в 1,7 раза (р≤0,05). При этом количество Streptococcus spp.увеличилось в 3,1 раза (р≤0,001), Staphylococcus spp. (коагулазоотрицательных) –в 2,3 раза (р≤0,01), Enterobacter spp. – в 1,7 раза (р≤0,01) по отношению кконтрольной группе животных. В составе кишечного биоценоза данной48экспериментальной группы не были выявлены микроорганизмы родов Citrobacterи Enterococcus, тогда как отмечалось появление Staphylococcus aureus и бактерийрода Proteus (lgКОЕ=(5,87±1,48) и lgКОЕ=(3,12±0,45), соответственно).
На фонеприменения гентамицина в составе микробиоценоза ТК мышей количество грибоврода Candida увеличилось в 2,3 раза (р≤0,01). Изменение численностиE.coli(lac«-») и Salmonella spp. было статистически не значимым по отношению кконтрольной группе (таблица 2).Таблица 2 Количественный и качественный состав мукозной микробиоты ТКконтрольной группы животных и животных с экспериментальным ДБ (n=50)Количество микроорганизмов, lgKOE/г (M±m)группа животныхконтрольДБE.
coli (lac«+»)6,58±0,753,18±0,46***E. coli (lac«-»)3,48±0,575,22±0,73Enterobacter spp.3,01±0,475,08±0,48**Salmonella spp.5,07±0,636,14±0,76Citrobacter spp.3,74±0,720±0***Enterococcus spp.3,85±0,900±0***Streptococcus spp.2,14±0,556,64±0,78***Staphylococcus spp. (коаг.)2,54±0,675,87±0,94**Staphylococcus aureus05,87±1,48***Proteus spp.03,12±0,45***Candida spp.2,38±0,495,43±0,90**Lactobacillus spp.6,48±0,663,60±0,82*Bifidobacterium spp.8,10±1,054,76±0,94*Примечание: * – р≤0,05 по сравнению с контрольной группой, ** – р≤0,01 по сравнению с контрольнойВид микроорганизмовгруппой, *** – р≤0,001 по сравнению с контрольной группой.На основании полученных данных были построены матрицы количественныхпоказателей контрольной группы животных и животных с экспериментальнымДБ.ПрипроведениикорреляционныеКАбыливзаимосвязиустановленымеждустатистическиисследуемымипризнаками,значимыепричемвзаимосвязи характеризовались только прямой направленностью.
В группе«контроль» корреляционные взаимосвязи выявлены между бактериями родаCitrobacterигрибами(коагулазоотрицательными)родаCandidaибактериями(r=0,85);родаStaphylococcusEnterococcusspp.(r=0,78);49Staphylococcus spp. (коагулазоотрицательными) и E.coli (lac«-») (r=0,74);Enterococcus spp. и E.coli (lac«-») (r=0,72) (таблица 3).Таблица3Корреляционнаяматрицаколичественногосодержаниямикроорганизмов в муциновом слое ТК контрольной группы животных (n=50)НаименованиеE. coli1E.
coli2 Enterob SalmмикроорганизмаE. coli11,00E. coli2,181,00Enterob- ,35- ,101,00Salm- ,22- ,34,701,00Citr- ,53- ,25,35,29Enteroc- ,08- ,03- ,24,72*Strept- ,00- ,03,39- ,03Staph,35- ,42- ,29,74*Cand- ,37- ,01,14,01Lact- ,66- ,34,49,55Bif- ,18- ,37,54,70* - статистически значимые коэффициенты (р<0,05).CitrEnterocStreptStaphCandLactBif1,00- ,30,03- ,33,85*,36,071,00- ,09,78*- ,22- ,09,131,00- ,27- ,30- ,46- ,231,00- ,21- ,44- ,131,00,39- ,211,00,641,00КЛА выявил приоритетность во взаимосвязях, которые получили отражение вдендрограммах корреляционных взаимосвязей количественного содержаниямикроорганизмов в муциновом слое ТК контрольной группы животных иживотных с экспериментальным ДБ.
В контрольной группе количественныепоказатели микроорганизмов формировали два взаимно не связанных кластера:первый кластер составили бактерии рода Citrobacter и грибы рода Candida,второй кластер – Staphylococcus spp. (коагулазоотрицательные) и бактерии родаEnterococcus, который был последовательно связан с содержанием E.coli (lac«-»)(дендрограмма 1).50Дендрограмма 1 корреляционных взаимосвязей количественного содержаниямикроорганизмов в муциновом слое ТК контрольной группы животныхВ муциновом слое ТК животных с экспериментальным ДБ характер корреляцийимел свои отличия – взаимосвязи проявлялись между Lactobacillus spp.
иStaphylococcus aureus (r=0,83); Staphylococcus spp. (коагулазоотрицательными) ибактериями рода Streptococcus (r=0,83); Staphylococcus aureus и Streptococcus spp.(r=0,79); Staphylococcus aureus и бактерями рода Proteus (r=0,78) (таблица 4).Таблица4Корреляционнаяматрицаколичественногосодержаниямикроорганизмов в муциновом слое ТК животных с экспериментальным ДБ(n=50)НаименованиеE.
coli1E. coli2 Enterob SalmмикроорганизмаE. coli11,00E. coli2- ,191,00Enterob,67- , 591,00Salm,06- ,02,241,00Strept,16,04,22- ,62Staph,25,42,14- ,36Staph. au,20- ,25,28- ,49Prot- ,20,02- ,27- ,33Cand- ,41- ,17,09- ,44Lact,34- ,37,42- ,42Bif,08,07- ,37-, 10* - статистически значимые коэффициенты (р<0,05).StreptStaphStaph. auProtCandLactBif1,00,82*,79*,46,31,70- ,511,00,38,10,31,70- ,511,00, 78*- ,11,83*- ,331,00- ,37,53- ,181,00,04- ,401,00- ,461,0051Выполненный на базе корреляционной матрицы КЛА показал, что при ДБотмечена перегруппировка взаимосвязей – сформировалось 2 кластера – междуLactobacillusspp.и(коагулазоотрицательными)Staphylococcusибактериямиaureus,родаStaphylococcusStreptococcus,spp.которыевзаимосвязаны друг с другом и последовательно связаны с количественнымсодержанием бактерий рода Proteus (дендрограмма 2).Дендрограмма 2 корреляционных взаимосвязей количественного содержаниямикроорганизмов в муциновом слое ТК животных с экспериментальным ДБПроведенный сравнительный анализ корреляционных матриц показателейколичественного состава микробиоценоза ТК установил значимые статистическиеразличия в характере взаимного варьирования между контрольной группой игруппой животных с экспериментальным ДБ.
Наблюдаемое значением Fотношения между корреляционными матрицами было больше теоретическиожидаемого значения в 88,6 раз, что подтверждает результат негативного влиянияксенобиотикагентамицина,обусловленногоразвитиемантибиотик-ассоциированного ДБ ТК, на организм животных, в частности, на микробиоту ТК(таблица 5).52Таблица 5 Величина F-отношения между корреляционными матрицами приэкспериментальном ДБНаименование сравниваемых группКонтроль - ДБВеличина F(наблюдаемоезначение)177,25 р<0,001Величина F(теоретическиожидаемое)2,00 р<0,053.2 Биохимические показатели крови и колоноцитов мышей в условияхэкспериментального дисбиозаОпределен уровень протекания процессов ПОЛ в организме контрольнойгруппы животных и животных с экспериментальным ДБ. Установлено, чтосодержание MDA в контроле составило в плазме крови 2,41±0,18, в колоноцитах –2,32±0,19.
Содержание AGP в плазме крови – 0,86±0,07, в колоноцитах –0,35±0,04. При ДБ содержание MDA увеличилось в 1,7 раза (р≤0,001) в плазмекрови и в 2,0 раза (р≤0,001) в колоноцитах. Концентрация AGP в условиях ДБтакже характеризовалась увеличением – в 1,4 раза (р≤0,01) в плазме крови и в 2,3раза (р≤0,001) в колоноцитах (таблица 6).Таблица 6 Содержание продуктов ПОЛ в контрольной группе животных иживотных с экспериментальным ДБ (n=50)Группа животныхКонтрольДБСодержание MDA, (М±m)плазма,колоноциты,мкмоль/лмкмоль/г ткани2,41±0,182,32±0,193,98±0,31***4,67±0,37***Содержание AGP, (М±m)плазма,колоноциты,у.е.у.е0,86±0,070,35±0,041,24±0,10**0,82±0,06***Примечание: ** - р≤0,01 по сравнению с контрольной группой, *** - р≤0,001 по сравнению с контрольнойгруппой.В ходе определения активности ферментов системы АОЗ (KAT и SOD) вколоноцитах и в плазме крови контрольной группы животных полученыследующие результаты: активность KAT составила 11,87±1,11 в плазме крови и13,88±0,85 в колоноцитах, активность SOD – 14,47±0,74 и 15,85±1,03,соответственно (таблица 7).53Приэкспериментальномантибиотик-ассоциированномДБданныеисследования (таблица 7) показывают, что активность фермента KAT снизиласьна 22,7% (р≤0,05) в плазме крови и на 23,4% (р≤0,01) в колоноцитах по сравнениюс контролем.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
