Диссертация (1154497), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Материалы и методы исследования2.1 Описание схемы эксперимента и методики введения препаратовВ качестве экспериментальной модели для проведения исследования быливыбраны лабораторные животные – белые мыши линии BALB/c, т.к. даннаялиния мышей чаще других используется в медико-биологических исследованиях– мыши обладают большей продолжительностью жизни и чувствительны кжелудочно-кишечным инфекциям [Каркищенко В.Н., 2007], что делает линиюBALB/c оптимальной моделью для изучения дисбиотических состоянийорганизма.
Согласно руководству по лабораторным животным и альтернативныммоделям в биомедицинских технологиях каждая экспериментальная группамышей должна состоять не менее чем из 10 особей [Каркищенко Н.Н., 2010].Исследование проведено на 350 мышах массой 18-20 г. Все животные былиразделены на семь экспериментальных групп по 50 особей в каждой. Животныхсодержали в идентичных условиях вивария (температура, относительнаявлажность, освещение и рацион питания) [ГОСТ 33216-2014].Для оценки результатов исследования использовали принцип прямого переносаданных для животных на человека, так как реакции мышей на действиексенобиотиков во многом подобны таковым у человека по изучаемым намипоказателям – количественный и качественный состав мукозной микробиоты ТК,состояние системы АОЗ и уровня протекания ПОЛ в колоноцитах и в плазмекрови [Каркищенко В.Н., 2004; Чичерин И.Ю., 2012; Бурмистров В.А., 2017].Готовые препараты (антибиотик гентамицин – ООО «Фармгарант РУС»(РеспубликаБеларусь),антиоксидантмексидол–ФКП«Армавирскаябиофабрика» (Россия), пробиотик бактистатин – ООО «КРАФТ» (Россия) исинбиотик нормобакт – Medana Pharma Terpol Group (Польша)) вводилиэкспериментальным группам животных, а 0,9% физиологический раствор– ОАО«Биохимик» (Россия) – контрольной группе животных через равные интервалывремени между каждым введением по установленной схеме.
Водные растворыпрепаратов готовили непосредственно перед приемом. Введение препаратов41мышам осуществляли после выбора необходимой дозы, исходя из рекомендуемойв аннотации на каждый препарат среднесуточной дозы для человека (всоответствии с межвидовым переносом доз с учетом удельной поверхности тела)[Хабриев Р.У., 2005; Каркищенко Н.Н., 2010]. Введение животным препаратов сдоказанным пробиотическим эффектом осуществляли в течение 21 дня –ориентировочное время достижения результата для оценки отсутствия признаковДБ ТК [ОСТ 91500.11.0004-2003].Первую группу составили мыши, которым не вводили препараты. Вместопрепаратов животные получали идентичный объем 0,9% физиологическогораствора с соблюдением способов введения используемых в экспериментепрепаратов (группа «контроль»).Во вторую группу входили мыши, у которых моделировали лекарственный ДБпутѐм внутрибрюшинного введения в течение 5 дней 1 раз в сутки растворагентамицина концентрации 40 мг/мл (группа «ДБ») [Кашкин К.П., 1984].Мышам третьей группы по окончании введения антибиотика интрагастральновводили пробиотик бактистатин в течение 21 дня 1 раз в сутки (группа«коррекция бактистатином»).Животные четвѐртой группы после формирования ДБ интрагастральнополучали пробиотик нормобакт в течение 21 дня 1 раз в сутки (группа«коррекция нормобактом»).Пятую группу составляли животные, которым для профилактики ДБвнутримышечно вводили антиоксидантный препарат мексидол концентрации 50мг/мл в течение 10 дней 1 раз в сутки до начала введения гентамицина (группа«профилактика мексидолом»).Мышам шестой группы для коррекции ДБ внутримышечно вводилиантиоксидант мексидол концентрации 50 мг/мл в течение 10 дней 1 раз в суткипосле окончания введения гентамицина (группа «коррекция мексидолом»).Седьмую группу составляли животные, которым одновременно осуществляликоррекцию ДБ антиоксидантным препаратом и пробиотиком по схеме:внутрибрюшинное введение в течение 5 дней 1 раз в сутки раствора42гентамицина; внутримышечное введение мексидола в течение 10 дней 1 раз всутки после окончания введения гентамицина; интрагастральное введениепробиотика бактистатин в течение 21 дня 1 раз в сутки после введенияантиоксидантного препарата.Животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирнымнаркозом с соблюдением принципов Европейской конвенции по защитепозвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научныхцелях (Совет Европы.
Страсбург, 2004 г.) [Каркищенко Н.Н., 2010].2.2 Изучение состава мукозной микробиоты толстой кишкиПри ДБ нарушается соотношение между анаэробной и аэробной микробиотой:снижается численность Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., E.coli (lac «+»). Всвою очередь снижение численности анаэробной микробиоты, обладающейантагонистической активностью, создает условия для развития условнопатогенной микробиоты: Staphylococcus spp., Enterobacter spp., Candida spp. и др.Приэтомприменяемыйвисследованиидлясозданияантибиотик-ассоциированного ДБ гентамицин высокоактивен в отношении аэробныхграмотрицательных бактерий, аэробных грамположительных кокков и некоторыхштаммов Streptococcus spp, но к гентамицину устойчива анаэробная микробиота.Учитываяданнуюинформацию,дляоценкифизиологическойнормымикробиоценоза ТК мышей в составе полостной микробиоты с использованием350выделенныхкультурпроводилиидентификациюследующих13представителей микроорганизмов: E.coli (lac «+»); E.coli (lac «-»); Enterobacterspp.; Salmonella spp.; Citrobacter spp.; Proteus spp.; Enterococcus spp.;Streptococcus spp.; Staphylococcus spp.
(коагулазоотрицательные); Staphylococcusaureus; Candida spp.; Lactobacillus spp.; Bifidobacterium spp. [ОСТ 91500.11.00042003; Шитов Л.Н., 2008; Чичерин И.Ю., 2012; Гапон М.Н., 2014; Бурмистров В.А.,2017].После окончания введения препаратов по указанной схеме у мышейконтрольной группы, а также экспериментальных групп проводили изучение43состава мукозной микробиоты ТК по методике Л.И. Кафарской и В.М. Коршунова[Кафарская Л.И., 2002].
В первую очередь осуществляли освобождение слизистойоболочки ТК от химуса и взвешивали полученный материал в асептическихусловиях, помещали его в стерильный раствор фосфатного буфера рН 7,0 всоотношении 1:10 и выдерживали в буфере в течение 2 часов для разжижениямуцина. После чего делали разведение материала до 10-2-10-4 для посева напитательные среды, термостатирования, изучения микробиоценоза ТК каждойгруппы животных и приготовления препаратов для микроскопирования послеокраски по Граму.
По 0,1 мл образца каждого разведения засевали газоном наповерхности питательных сред (Эндо, кровяной агар, желточно-солевой агар,Сабуро, SS-агар, лактоагар, ЦПХ-агар, висмут-сульфит агар, бифидоагар) иинкубировали в аэробных и анаэробных условиях при температуре 37 0С. Числовыросших КОЕ микроорганизмов для оценки количества микроорганизмов в 1гматериала (рост не менее 10 колоний), определяли с учетом объѐма посевногоматериала и разведения. Расчеты проводили по следующей формуле: К=Е/к·v·n,где К – КОЕ, Е – общее количество бактерий, к – количество внесѐнногоматериала, v – количество чашек Петри, n – разведение.
Удельное содержаниемикроорганизмов выражали в lgКОЕ/г массы биологического материала.Идентификацию микроорганизмов проводили с помощью микробиологическогоанализатора «Multiskan-Ascent» с использованием промышленных тест-системЭНТЕРОтест-16, СТАФИтест-16, Стрептотест-16, Эн-КОККУСтест-16, API 50CHL [Воробьев А.А., 2005; Несвижский Ю.В., 2007].2.3 Оценка состояния системы антиоксидантной защиты организма ипроцессов липопероксидацииНа следующем этапе работы исследовали состояние системы АОЗ организма поактивности основных ферментов – SOD и KAT и интенсивность протеканияпроцессов ПОЛ по содержанию в организме основных продуктов – AGP и MDAдлякаждойгруппыживотных.Материалдляпроведенияизмеренийподготавливали следующим образом: плазма крови – забор крови у мышей44проводиливстерильнуюпробиркудляцентрифугиобъемом10мл,предварительно распределяя раствор гепарина по внутренней поверхностипробирки, после добавляли 2 мл крови.
Центрифугировали при 1500 оборотах втечение 20 минут. Фугат (плазму) забирали и помещали в коническуюстерильную микропробирку объемом 1,5 мл. Пробы помещали для хранения вхолодильник при температуре (-25)оС. 120 мг ткани ТК взвешивали нааналитических весах, помещали в гомогенизатор, измельчали до однородноймассы с добавлением 1 мл 0,025 М трис-НСl буфера (pH 7,4). Получившуюсясмесь помещали в коническую стерильную микропробирку объемом 1,5 мл.Пробы помещали для хранения в холодильник при температуре (-25) оС.2.3.1 Определение активности супероксиддисмутазы и каталазыАктивность SOD определяли спектрофотометрически.
Данный метод основанна определении степени торможения реакции восстановления нитросинеготетразолия. Для этого 0,02 мл экстракта гомогената ткани ТК или плазмы кровивводили в 3 мл инкубационной среды, содержащей 0,41 мМ нитросинеготетразолия, 0,33 мМ ЭДТА, 0,01 мМ N-метилфеназония метилсульфата. Измерялиоптическую плотность на спектрофотометре «Apel 330 PD» (Япония) при длиневолны 540 нм, затем добавляли в кювету 0,1 мл 0,8 мМ НАД-Н, перемешивали иоставляли в темном месте на 10 мин, после чего повторно измеряли оптическуюплотность.
О реакции судили по разнице между первым и вторым показаниямиспектрофотометра. За условную единицу активности SOD принимали 50%торможение реакции восстановления нитросинего тетразолия. Активность KATопределялитакжеспектрофотометрически.Данныйметодоснованнаспособности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкийокрашенный комплекс.
Для этого к 0,1 мл плазмы крови или гомогената ткани ТКдобавляли 2,0 мл 0,03% раствора перекиси водорода. После инкубации при 37 оСв течение 10 минут тормозили реакцию путем добавления 1,0 мл 4% растворамолибдата аммония. Интенсивность окраски измеряли при длине волны 410 нм сиспользованием спектрофотометра «Apel 330 PD» (Япония). Активность KAT45рассчитывали по формуле: А (мкатЕхол−Еоп ∙3,1лТ∙∙22,2∙10 3)=, выражали в мкат/г ткани вколоноцитах или мкат/мл в плазме крови [Кушманова О.Д., 1983; Строев В.А.,1986; Королюк М.А., 1988; Макаренко Е.В., 1988].2.3.2 Определение содержания малонового диальдегида иацилгидроперекисейСодержание AGP в организме определяли спектрофотометрически.
Данныйметод основан на образовании гептанового слоя при смешении гептана иизопропана с добавлением соляной кислоты. Измеряли оптическую плотностьобразовавшегося гептанового слоя на спектрофотометре «Apel 330 PD» (Япония)при длине волны 233 нм и сравнивали с показаниями контрольной пробы,результат оценивали в условных единицах активности. Для этого к 0,2 млгомогената ткани ТК или плазмы крови добавляли 6 мл смеси гептана иизопропанола, затем приливали 1 мл соляной кислоты и интенсивно встряхивали.После расслоения фаз отбирали гептановый слой, в котором измеряли содержаниеAGP.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
