Диссертация (1154377), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Образовавшийся солевой растворбелков оставляли на 76-80 часов при Т=40С. Собирали фракцию супернатанта,раствор диализовали до отрицательной реакции на NH4+-ионы [243].Исходнаяконцентрациябелкавсупернатантахсоставляла0,1мг/мл.Путёмпоследовательного десятикратного разведения были приготовлены образцырастворов: супернатанта экстракта печени (СПК) в концентрациях 0,1∙10-12,0,1∙10-9, 0,1∙10-6, 0,1∙103 и 0,1∙10-1 мг белка в 1мл раствора и супернатантаэкстракта легкого крыс (СЛК) в концентрациях 0.1∙10-4, 0,1∙10-6, 0,1 ∙10-12 мг/мл.982.3.2. СинтезированныепептидыпредоставленыИнститутомбиоорганической химии им.
академиков Ю.А. Овчинникова и М. М. Шемякина[244].Структура пептидов:✓IAEIPTQKPAADVQFGSL — «А4» (Изолейцил- аланил- глутамил-изолейцил-пролил - треонил - глутаминил – лизил- пролил-аланил-аланиласпарагил-валил-глутаминил-фенилаланил-глицил-серил-лейцил);✓LNVVIGKHGLL — «A2» (Лейцил-аспарагинил-валил-валил-изолейцил-глицил-лизил-гистидил-глицил-лейцил-лейцил).Для раствора каждого пептида исходная концентрация С=1мг/мл. Былиприготовлены,также,десятикратныеразведенияисходныхрастворов:С=0,1мг/мл и С=0,01мг/мл. Растворитель — 0,05 моль/л раствор фосфатно—боратного буфера, рН 7,4-7,6, профильтрованный через фильтр «Millex» сдиаметром пор 0,22 мкм.2.3.3.Бычийсывороточныйальбумин/BovineSerumAlbuminлиофилизированный, фракция V, содержащий не менее 98% альбумина,очищенный от жирных кислот по методике R.F. Chen [245].
ПроизводительSigma-Aldrich (Merck), CША. Исходная концентрация раствора бычьегосывороточного альбумина составляла С=10мг/мл. Были приготовлены, также,десятикратные разведения исходных растворов: С=1мг/мл, С=0,1мг/мл,С=0,01мг/мл. Растворителем выступала вода Mili-Q, прошедшая фильтрованиечерез фильтр «Millex» с диаметром пор 0,22 мкм.2.4.БАКТЕРИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ШТАММА E.
COLI K-12В работе использовались клетки эталонного ауксотрофного штамма C600(thr leu Str), являющегося производным штамма К-12 из коллекции музеяштаммов, созданного профессором Пеховым АП. и профессором Иткесом А.В.на кафедре биологии и общей генетики РУДН. Были изучены как99бесплазмидные бактерии, так и варианты, содержащие F-подобные плазмидыpAP22-2 и pAP42. Плазмиды маркированы путем включения в их структурутранспозонов Tn1 и Tn9, содержащих гены устойчивости бактерий кампициллину и хлорамфениколу, соответственно [246].2.5.КАЛИБРОВОЧНЫЕ ЛАТЕКСНЫЕ МИКРОСФЕРЫЛатексные частицы /Latex Particles (микросферы) ‒ сферические частицы вколлоидном диапазоне размеров, полученные из аморфного полимера‒полистирола [247].
Полимерные водные суспензии с узким распределениемчастиц по размерам применяются: в качестве калибровочных эталонов вэлектронной и оптической микроскопии и светорассеивании; для определенияразмера пор фильтров и биологических мембран; в качестве модельныхколлоидов; для исследования кинетики и механизма пленкообразования излатексов; а также в качестве полимерных носителей биологических лигандов виммунохимических исследованиях [248].Производитель: «Invitrogen Molecular Probes», США. Название продукта:сульфатированные латексные частицы, 8%, приготовленные на деионизованнойводе. Калибровочные размеры: «0,02мкм, 0,06мкм,0,08мкм, 0,1мкм,0,2мкм,0,4мкм, 0,8мкм, 0,9мкм, 1мкм, 1,6мкм, 1,8мкм, 3мкм, 10мкм» [247].
Показателикачестваводныхсуспензийкалибровочныхпредставлены в табл.20. на примере 1мкм частиц.латексныхмикросфер100Таблица 20. Спецификация сульфатированных латексных частиц, 8% 1мкмПоказатель качестваНормаРезультат(по Спецификации)Описание*Белая суспензияСоответствуетПлотность при Т=200С, г/см31,055СоответствуетПоказатель преломления при длине 1,591Соответствуетволны света 589,3 нм (линия Dспектра натрия) и Т=200СЗначение диаметра сферы, d,мкм0,95 – 1,101SD, d, мкм0,0330,033Концентрация, %7,5-8,58Число частиц в 1мл суспензии1,5·1011СоответствуетУдельная площадь поверхности**, 5,7·104Соответствуетсм2/гПлотностьповерхностного 1,9Соответствуетзаряда***, мкмК/см2Площадь,занимаемаясульфо- 851А2/SO42-СоответствуетгруппойХранениеПриТ=2-80С,незамораживать!* Отрицательно заряженные полистирольныефункциональными группами на поверхности.** Поверхность – гидрофобная.*** Поверхностный заряд – рН-зависимый.микросферыссульфатнымиАликвоту исходнойводной суспензии разводили в стерильном флаконенеобходимым количеством растворителя — воды до концентрации 1·10-5 % ифильтровали через 0,22 мкм фильтрыMillex.1012.6.ОБРАЗЦЫ ВОДЫ2.6.1.
Воды с разным соотношением D/H:✓вода с пониженным содержанием дейтерия («протиевая» вода, «легкаявода», deuterium depleted water, ddw); производитель: ОАО «Алмаз»,предоставлена ЗАО «Легкая вода»; система очистки ‒ низкотемпературнаявакуумная ректификация воды, основанная на фазовом изотопном обмене:HDO(пар) + H2O(ж) H2O(пар) + HDO(ж);По результатам анализа изотопного состава воды с помощью изотопногоанализатора Picarro, основанного на методе WS-CRDS (Wavelength ScannedRing Down Spectroscopy/Спектроскопия поглощения света в многопоточныхнеаксиальных кюветах при сканировании по длинам волн) [249], содержаниедейтерия D составляет 4ppm;✓бидистиллированнаядеионизированнаявысокоомнаявода(удельноеэлектрическое сопротивление18 МОм·см при Т=25°С) природного изотопногосостава, полученная путем очистки пирогенной дистиллированной воды наустановке Milli-Q (Millipore, Великобритания), концентрация 1Н216О 99.74 мол.% (D/H = 141,0±0,9 ррm);✓тяжелая вода 99,9 % D2O.
Производитель “Deutero GmbH” (табл. 21).Таблица 21. Спецификация растворителя D2OПоказатель качестваНормаИзотопная чистота99,9 атом. % D*Показатель преломленияnD20 = 1,328Ткип, 0С101,4Тпл, 0С3,8Плотность, г/мл при Т=250С1,107*Содержание воды установлено кулонометрическим титрованием по методуК.Фишера.102Качество вод соответствовало, также следующим параметрам:✓отсутствию частиц дисперсной фазы;✓элементному составу (от Al до Pb) <1 нг/л;✓содержанию общего органического углерода (ООУ) <0,01 мг/л;✓удельной электропроводности (≥5 мкС/м при Т=25 ºС).2.6.2.
Минеральные бутилированные водыВ работе исследовались образцы воды отечественных и зарубежныхторговых марок как природного происхождения, так и искусственноприготовленных, различной минерализацией (табл. 22) [132].В работе исследованы, также образцы лечебно-столовых бутилированныхводминерализациейот1до10г/л:"Новотерскаяцелебная"(АО"Кавминводы«), "Ессентуки-17» (Ессентукский завод мин.вод), "Нарзан« (АО«Нарзан»).103Таблица 22. Сводные данные о бутилированных минеральных водах минерализацией до 1г/л [132].104105Таблица 22.
Сводные данные о бутилированных минеральных водахминерализацией до 1г/л(продолжение)106107108Все образцы воды для исследования методом LALLS фильтровались через фильтры Millex с d=0,22мкм за 1 час доначала измерений.1092.6.3. н−Гексанн-Гексан (хч) для ГЖХ (табл. 23) использовали в качестве фоновогообразца в приборах, основанных на лазерном светорассеянии, для полученияразмерных спектров водных кластеров (см. Главу 3.4.3).Таблица 23. Спецификация н-Гексан хч (ТУ 2631-061-44493179-01)Показатель качестваНормаОписание, формулабесцветнаяжидкостьC6H14Массовая доля, %Не менее 99,85Показатель преломленияnD20 = 1,3740-1,3760Плотность при Т=20 °С,0,010Ткип, С68,0-69,00Тпл, С3,8Массовая доля воды, %Не более 0,005Массоваядоляароматических Не более 0,05углеводородов общая, %Массовая доля нелетучего остатка, % Не более 0,0001прозрачнаяАликвоту н-гексана фильтровали через фильтр “Millex”.МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.7.ИК-СПЕКТРОСКОПИЯДля определения подлинности исследуемых субстанций применяли ИК‑Фурье-спектрометр Cary 630 (Agilent Technologies, США) с приставкойНПВО (нарушенного полного внутреннего отражения / ATR-аttenuated totalreflection).ПриставкаНПВОсалмазнымкристалломформируетспектрограммы высокого качества без предварительной подготовки проб(табл.24).110Таблица 24.
Технические характеристики приставки НПВО с алмазнымкристалломПоказатель качестваПодлинность,количественноесодержаниеТип зажимного устройстваФрикционнаямуфтапрессадляобеспечения стабильного давленияДлина оптического пути1,2 мкм при 1700 см-1Спектральный диапазон (для ИК- от 7000 до 350 см-1Фурье-спектрометра с окном из KBr)Перед каждым анализом записывался спектр фона для исключениявлияния изменений окружающей среды.
Небольшая навеска анализируемоговещества измельчалась в агатовой ступке и помещалась на алмазныйкристалл НПВО. При анализе пробы прижимное устройство опускалось дохарактерного щелчка, означающего достижение максимального контактамежду пробой и ИК-лучом, выходящего из алмазного окна приставки.Спектры получены в среднем ИК-диапазоне (400 – 4000 см-1) cмаксимальным разрешением 2 см-1. Система Cary 630 управляетсяпрограмным обеспечением Agilent MicroLab PC.
Работа и анализ спектровпроводится в специализированной программе ResolutionPro.2.8.УФВ-СПЕКТРОСКОПИЯУФВ-спектрысубстанцийрегистрировалиспомощьюспектрофотометра Agilent Cary 60, предназначенного для измерениякоэффициента пропускания и оптической плотности твердых и жидких пробразличного происхождения (табл.25).111Таблица 25. Технические характеристики Agilent Cary 60МонохроматорПосхемеЧерни-Тернера(двасферического зеркала: для коллимацииидляфокусировкиизлучениянавыходную щель)ИсточникИмпульсная Xe лампа непрерывногоспектра(80 Гц)Детекторы2 Детектора на кремниевых диодах дляодновременного измерения в рабочем иэталонном лучеСпектральный диапазонот 190 до 1100 нмПредельное разрешение УФ-В (нм)≤ 1,5 нмВоспроизводимость длины волны±0,1 нмТочность установки длины волны±0,5 нмФотометрическая точность (Abs)±0,005 ед.погл.Макс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
