Диссертация (1154329), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Контрольная группаполучала плацебо (дистиллированную воду). У животных определялосьсоотношение метаболитов эстрогенов 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 в моче в ходеэксперимента.Изменениясоотношенийметаболитовэкспериментальных животных представлены на рисунке 1.141эстрогенову5среднее соотношение 2-ОНЕ1/16-ОНЕ14,543,532,521,510,500123456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30день экспериментаопытная группаконтрольная группаРисунок 1.
Соотношение метаболитов эстрогенов 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 вмоче у мышей, получающих дииндолилметан (среднее значение и стандартноеотклонение).У мышей в опытной группе наблюдается увеличение соотношения 2ОНЕ1/16α-ОНЕ1, тогда как в контрольной группе оно не меняется. По окончанииэксперимента соотношение 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 в экспериментальной группевыросло до 3,8±0,91, тогда как в контрольной оно осталось столь же низким, каки до начала эксперимента – 0,84±0,36. Увеличение относительного уровняметаболита 2-ОНЕ1 (не обладающего канцерогенным действием) в группемышей, получающих DIM, свидетельствует о благоприятном измененииметаболизма эстрогенов. Полученные нами результаты позволяют доказать вкачестве значимого механизма действия DIM в отношении торможения ростаксенографтов опухолей влияние на метаболизм эстрогенов и эстрогеновуюрегуляцию пролиферации путем стимуляции преимущественного образования 2ОНЕ1, обладающего антипролиферативным действием.1424.3.
Влияниедииндолилметананатуморогенностьклетоклинийзлокачественных опухолей и раннее развитие опухолиЭксперименты состояли из проверки прямого противоопухолевогодействия на ранних стадиях развития злокачественного новообразования ипроверки влияния на туморогенность опухолевых клеток линии рака простатычеловека. В работе использовались клетки рака простаты человека CRL-1740(LNCaP) и CRL-1435 (PC-3). После окончания периода карантина и разделенияна группы животным подкожно перевивали клетки линий рака простаты. Висследовании влияния Инфемина на ксенографты опухолей через 3 дня послеимплантации раковых клеток животных разделяли на 4 экспериментальныхгруппы, по 30 животных в каждой, и начинали лечение исследуемым препаратом(контрольные группы получали плацебо) [Kiselev V.I., 2014].Как было установлено, с 31 по 42 дни после перевивки препарат оказывалвыраженный противоопухолевый эффект на развитие рака простаты человекаCRL-1740 (LNCaP); значение торможения роста опухоли в группе, получавшейИнфемин, по сравнению с контрольной группой на 31-42 дни составляло 55,5%и 16,9% (таблица 52).
Данные отличия были статистически значимы.Таблица 52. Влияние препарата Инфемин на размер опухоли ракапростаты человека CRL-1740 (LNCaP) в различные дни после перевивкиСредний объем опухолей, мм3День исследованияПлацебоИнфемин120111422.725.81726.324.41926.322,92023.425.92225.321.82526.218.7143T/C%113.4%92.8%87.1%110.8%86.0%71.3%t-testp<0.052832.73151.13390.937180.939330.642572.3* — значимые отличия от контроля23.528.330.136.355.596.771.9%55.5%33.1%20.1%16.8%16.9%*****В эксперименте с линией CRL-1435 (PC-3) также было установлено (см.таблицу 53), что с 33 по 42 дни после перевивки препарат оказывал выраженныйпротивоопухолевый эффект на развитие рака простаты человека CRL-1435 (PC3); значение торможения роста опухоли в группе Инфемин по сравнению сконтрольной группой на 33-42 дни составляло 69,3% и 26,0%. Данные отличиябыли статистически значимы.Таблица 53.
Влияние препарата Инфемин на размер опухоли ракапростаты человека CRL-1435 (PC-3) в различные дни после перевивкиСредний объем опухолей, мм3День исследованияПлацебоИнфемин12981423.521.21729.626.81930.129.22032.230.42229.931.02533.429.72836.938.33158.844.933130.190.137198.5120.239446.4199.342848.5220.6* — значимые отличия от контроля144T/C%88,9%90,2%90,5%97,0%94,4%103,7%88,9%103,8%76,4%69,3%60,6%44,6%26,0%t-testp<0.05****Противоопухолевоепродолжительностивоздействиежизнипрепаратаэкспериментальныхотразилосьтакжеживотных.наСредняяпродолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитымиопухолевыми клетками рака простаты человека CRL-1740 (LNCaP) составила30,4 дня.
Введение препарата Инфемин также статистически значимо увеличилопродолжительность жизни у мышей (до 67,8 дней), при этом процент увеличенияпродолжительности жизни по сравнению с контролем составил 123%. Средняяпродолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитымиопухолевыми клетками линии рака простаты человека CRL-1435 (PC-3)составила 30,1 дня.
Введение препарата Инфемин значимо увеличилопродолжительность жизни у мышей (до 64,8 дней), при этом процент увеличенияпродолжительности жизни по сравнению с контролем составил 115%.В исследовании влияния препарата на туморогенность клеток опухолей вдень имплантации раковых клеток животных разделяли на 4 экспериментальныхгруппы, по 20 животных в каждой, и начинали лечение исследуемым препаратомпо аналогичной схеме, но при этом использовалась в два раза уменьшеннаяпрививочная доза клеток – 2,5х106 клеток.
Частота образования опухолей вопытной и контрольной группах в эксперименте по изучению влияния Инфеминана туморогенность опухолевых клеток представлена в таблице 54.Таблица 54. Влияние препарата Инфемин на частоту имплантацииопухолей рака простаты человека при перевивке у мышейЛиния клетокCRL-1740Прививочная дозаИнтервенцияКоличествомышей спальпируемойопухольюЧастотаимплантацииопухолей2,5x106 клетокрастворитель1890,0 %2,5x106 клетокИнфемин,133 мг/кг1155,0 %*(LNcaP)1452,5x106 клетокрастворитель1995,0 %2,5x106 клетокИнфемин,133 мг/кг1365,0 %*CRL-1435 (PC3)* — значимые отличия от контроля (p<0.05 по критерию хи-квадрат)Полученные результаты указывают на способность препарата Инфеминснижать туморогенность клеток линий рака простаты человека CRL-1740(LNCaP) и CRL-1435 (PC-3).
Частота образования опухолей снижается на 3035%. Таким образом, в результате проведенных исследований можно сделатьследующие основные выводы:1. Инфемин обладает способностью снижать туморогенность клетоклиний рака простаты человека.2. Инфемин проявляет выраженное противоопухолевое действие invivo и тормозит рост опухолевых клеток рака простаты человека умышей,чтопроявилосьвдостоверномувеличениипродолжительности жизни, а также в торможении роста опухоли.3. Данные эффекты не зависят от наличия либо отсутствиягормончувствительности клеток, что свидетельствует о том, что вподавлении туморогенности не задействованы гормональныемеханизмы.Необходимо подчеркнуть, что аналогичные результаты по подавлениюроста ксенографтов опухолей были получены и отношении клеточных линийрака эндометрия [Киселев В.И., 2014].4.4. Механизмы активности дииндолилметана in vitroДля экспериментов были использованы клетки линий рака простатыкрысы CRL-2376 (MAT-Ly-Lu) и рака простаты человека CRL-1740 (LNCaP) иCRL-1435 (PC-3).
Выживаемость опухолевых клеток после 48 часов инкубации146с препаратом оценивали с помощью МТТ-теста, выражая в процентах отсоответствующего контроля.Было проведено пять независимых экспериментов. Одна точка вэксперименте представляла собой среднюю величину из пяти параллельныхизмерений. Величину IC50 определяли по графику зависимости остаточнойвыживаемости клеток (процент живых клеток относительно контроля) отконцентрации DIM. Для этой цели был проведен регрессионный анализ иполученоуравнениеэкспоненциальнойрегрессии,описывающееэкспоненциальную линии тренда путем расчета точек методом наименьшихквадратов.
Полученное уравнение использовалось для расчета IC50. Графикизависимости выживаемости клеток от концентрации препарата представлены наВыживаемость опухолевых клеток, %рисунках 2-4.100908070605040302010y = 115,39e-0,025x00255075100C, мкМРисунок 2.
Влияние препарата Инфемин на выживаемость опухолевыхклеток рака рака простаты человека CRL-1740 (LNCaP). Показано среднеезначение и стандартное отклонение.147Выживаемость опухолевых клеток, %1009080706050403020y = 101,5e-0,018x1000255075100C, мкМРисунок 3. Влияние препарата Инфемин на выживаемость опухолевыхклеток рака простаты человека CRL-1435 (PC-3). Показано среднее значение иВыживаемость опухолевых клеток, %стандартное отклонение.100908070605040y = 100,35e-0,011x30201000255075100C, мкМРисунок 4. Влияние препарата Инфемин на выживаемость опухолевыхклеток рака простаты крысы CRL-2376 (MAT-Ly-Lu). Показано среднеезначение и стандартное отклонение.148Экспоненциальныйрегрессионныйанализпозволилопределитьзависимость выживаемости клеток (в %) от концентрации препарата, котораясоставила для клеток CRL-1740 (LNCaP), CRL-1435 (PC-3) и CRL-2376 (MATLy-Lu) соответственно:выживаемость = 115,39е-0,025Свыживаемость = 101,5е-0,018Свыживаемость = 100,35е-0,011Сгде С – концентрация препарата.Определенная по данным формулам IC50 для опухолевых клеток ракапростаты человека CRL-1740 (LNCaP) составила 33,5 мкМ, CRL-1435 (PC-3) –39,3 мкМ, и для опухолевых клеток рака простаты крысы CRL-2376 (MAT-LyLu) – 63,3 мкМ.Для исключения влияния цитотоксического воздействия препарата наклеточные линии в аликвотах внеклеточной жидкости определялась степеньнекроза клеток по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
Некроз клеток ненаблюдался ни в одном из экспериментов. Поэтому можно сделатьпредположение о том, что препарат подавляет выживаемость опухолевых клетокпутем стимуляции апоптоза.По данным литературы, в исследовании Chen и др. [Chen D., 2012] былипредставлены данные о способности DIM вызывать апоптоз различных линийзлокачественных клеток простаты. Авторами была зарегистрирована гибельпутем апоптоза 80-90% клеток при обработке раковых клеток DIM вконцентрации 25 мкМ. Также цитостатические эффекты DIM были показаны наклеточных линиях рака эндометрия CRL-1622 и HTB-113 [Киселев В.И., 2014] иэндометриальных клетках человека Ishikawa [Leong H., 2001].
В концентрациидо 50 мкМ DIM проявляет антипролиферативные эффекты путем подавленияроста клеток. В концентрации свыше 50 мкМ уже наблюдалась индукцияапоптоза. Таким образом, наши данные подтверждают на примере новой149фармакомпозиции известные ранее данные о том, что DIM может вызыватьподавление выживаемости клеток рака простаты [Nachshon-Kedmi M., 2003].4.5. ЗаключениеТакимобразом,изучаемыеактивныесубстанцииобладаютвозможностью подавлять ряд механизмов раннего канцерогенеза, что делает ихперспективными для последующего создания средств химипрофилактики[Ашрафян Л. А., 2014; Друх В. М., 2015]. Однако, изученные на животныхмоделях механизмы, и, соответственно, способы их коррекции, требуютподтверждения их значимости у человека.150ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕМЕХАНИЗМОВРАННЕГОКАНЦЕРОГЕНЕЗА И СПОСОБОВ ИХ КОРРЕКЦИИ У ЧЕЛОВЕКАДляцелейопределенияролиизучаемыхмеханизмовраннегоканцерогенез в развитии онкологической патологии органов репродуктивнойсистемы человека был изучен ряд молекулярных маркеров этого процесса упациентов(припростатическойинтраэпителиальнойнеоплазии,доброкачественной дисплазии молочной железы, гиперплазии эндометрия).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
