Диссертация (1152315), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Градуировочные растворы последовательно вводили в49хроматограф в количестве 20 мкл и проводили разделение при рабочихрежимных параметрах.Подготовка проб для исследований осуществлялась следующимобразом: образец вина в объеме 2 см3 разбавляли дистиллированнойдеионизированной водой и затем фильтровали через мембранный фильтр срейтингом пор 0,45 мкл. Объем вводимой пробы составлял 20 мкл.Продолжительность анализа составляла 7 минут.Для определения качественного и количественного состава свободныхаминокислот использовали хроматографическую колонку Luna 5u С18(2)150×4,6 мм 5 micron (Phenomenex, США) с предколонкой. Пробоподготовкуи определение осуществляли в соответствии с методикой [80].
Производныеаминокислот предварительно получали с помощью альдегида ортофталевойкислоты и 2-меркаптоэтанола (ОРА реагент). Производные обнаруживали спомощью диодно-матричного детектора при измерительной длине волны 338нм и ширине полосы 10 нм, сравнительной длине волны - 390 нм и ширинеполосы - 20 нм. Объем инжекции - 20 мкл. Хроматограмма аминокислотпредставлена на рисунке 3.50Рисунок 3 – Хроматографический профиль аминокислот вина красногогеографического наименования выдержанного сухого «Крю ЛермонтСаперави Фанагория»Продолжительность анализа качественного и количественного составааминокислот – 60 минут.Для определений массовой концентрации моносахаров и глицеринаиспользовалась колонка хроматографическая Luna 5uNH2 100А 250×4,6 мм 5micron (Phenomenex, США) с предколонкой [81] (Рисунок 4).Режимные параметры работы хроматографа следующие:- скорость потока элюента (смесь деионизированной дистиллированнойводы с ацетонитрилом в соотношении 3:1)- 1,2 см3/мин;- температура термостата детектора - 30 °С;- температура термостата колонки - 30 °С;- объем инжекции пробы - 20 мкл.
Продолжительность анализа – 12минут.Рисунок 4 –Хроматографический профиль сахаров и глицерина винагеографическогонаименованиясухогономерной резерв», Краснодарский крайбелого«ШардонеФанагории51Качественный и количественный состав мономерных форм фенольныхсоединений осуществляли в соответствии с методикой [82]. Методикапозволяетпроводить измерение массовой концентрации фенольных ифурановых соединений в диапазоне измерений: для галловой кислоты, 4гидроксибензойной кислоты, ванилиновой кислоты, сиреневойкислоты,4гидроксибензойногоальдегида,ванилина,сиреневогоальдегида,п-кумаровой кислоты, феруловой кислоты, кониферилового альдегида от 0,10до 10,0 мг/дм3 включительно (Рисунок 5).Образецисследуемоговинапредварительнофильтроваличерезмембранный фильтр c размером пор 0,45 мкм.
Объем пробы – 20 мкл.Рисунок 5 – Хроматографический профиль мономерных формфенольных соединений вина сухого выдержанного «Гранд резерв КабернеСовиньон», МолдоваРабочие режимы хроматографа: колонка хроматографическая Hypersil 5uODS (С18)1 250×4,60 мм 5 micron (Phenomenex, США) с предколонкой,скорость потока элюента: 0,8 см3/мин.; подвижная фаза– смесь ацетонитрилаи буферного раствора в объемном соотношении (13:87); температуратермостата колонки– 20-25 °C.
Детектирование осуществляли по поглощениюв УФ-области спектра при длине волны 270, 310 и 330 нм. Выбор длин волн52обусловлен тем, что λ = 270 нм соответствует УФ-поглощению простыхфенолов, фенольных кислот и кольцу «А» флавоноидов;соответствуетУФ-поглощениюоксикоричныхкислот;λ = 310 нмλ=330нмобусловлена поглощением кольца «В» флавоноидов, кофейной кислоты икверцетина.Массовую концентрацию катионов и анионов определяли методомионообменной хроматографии с использованием хроматографа ионного«Metrohm Advanced Compact IC – 853» (Швейцария).
Катионный профильвина представлен на рисунке 6.Рисунок 6– Катионный профиль вина сухого красного защищенногонаименования «Маркиз де Карано. Темпранильо», Испания2.2.3 Спектрофотометрический анализСпектрофотометрический анализ проводили на спектрофотометре СФ 2000 («ОКБ Спектр», Россия) в кварцевой кювете с расстоянием междурабочими гранями (длиной оптического пути) 10 мм и 1 мм в диапазоне длинволн 250 – 700 нм. Данный метод использовался для регистрации величиныоптического поглощения исследуемых вин в ультрафиолетовой области придлине волны 280 нм (для белых вин) и в видимой части спектра при длинах53волн420 нм и520 нм(для красных вин).
В качестве раствора сравненияиспользовали дистиллированную воду. Выбор длин волн обусловлен тем, чтодлина волны 420 нм отвечает максимуму поглощения полимеризованныхфенольных соединений (гликозид кверцетина – рутин), а λ=520 нм –антоцианы и их триглицериды.Относительная погрешность измерения составила 0,3 %.2.2.4 Масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмойОпределение концентрации микроэлементов осуществляли методоммасс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС) на прибореELAN-9000 (―Perkin Elmer‖, Канада). Метод ИСП-МС отличается высокойчувствительностью и способностью определять ряд металлов и несколькихнеметаллов в концентрациях до 10−10%, т.e.
одну частицу из 1012.Методоснован на использовании индуктивно-связанной плазмы в качествеисточника ионов и масс-спектрометра для их разделения и детектирования.В отличие от атомно-абсорбционной спектроскопии, определяющейединовременно только один элемент, ИСП-МС может определять всеэлементы одновременно, что позволяет значительно ускорить процессизмерения.При определении микроэлементов в пробах вина использовалиследующие рабочие параметры прибора: напряжение на индукторе – 1150 В;напряжение на детекторе – 1600 В, импульсное напряжение – 800 В.Предварительно, для устранения мешающих факторов, полностьюразрушали в образцах вин органические вещества при температуре 450°С вприсутствии азотной кислоты. Пробы разлагали на автоматизированномкомплексе пробоподготовки «ТЕМОС-ЭКСПРЕСС» ТЭ-1 (производство –ООО «ИТМ», Россия).
Полученный минерализат растворяли в 0,5N раствореазотной кислоты. Продолжительность анализа одного образца – 20 минут.542.2.5 Хромато-масс-спектрометрия фенольных соединений винаАнализ фенольных соединений выполняли методом ВЭЖХ на прибореAgilent 1100 (Agilent Technologies, США) с диодно-матричным детекторомAgilent1100SeriesDiodeArray,автосамплеромипрограммнымобеспечением обработки хроматографических данных ChemStation.
Условияхроматографирования:- неподвижная фаза – сорбент ZORBAX Eclipse XDB-C 8 (США);- размеры колонки4,6 х 150 мм;- температура выполнения анализа - 25 °С;- элюент: метанол – 0,1 %-ный раствор трифторуксусной кислоты, градиентот 20 до 100% метанола, скорость потока элюента0,8 мл/мин.Объем пробы2,0 мкл. Аналитические длины волн -220, 254, 290, 326,360нмВЭЖХ/МС – анализ осуществляли с использованием жидкостногохроматографа с диодно – матричным и масс-селективным детекторами«Agilent 1100 Series LС/MSD».
Для масс-селективного детектора былиспользован метод химической ионизации при атмосферном давлении(APCI). Сканирование отрицательных ионов с m/z 100–700 с дискретностьюm/z 0,1. Рабочие параметры для APCI: поток газа-осушителя (азот) – 4дм3/мин. с температурой 340 °С. Температура испарителя – 400 °С.Разделение проводилось на колонке 4,6×150 мм, заполненной обращеннофазовым сорбентом Zorbax Rx-C18, 5μm.2.3 Математическая обработка экспериментальных данныхОбработка полученных экспериментальных данных осуществлялась сиспользованием методов математической статистики и компьютернойпрограммы Microsoft Excel 2011 [16, 66, 70].55За результат измерений массовой концентрации экстрактивныхкомпонентовпринималисреднееарифметическоерезультатовтрехпараллельных определений, если выполняется условие приемлемости (2.3.1):3 Сi1 Ci 2 100(Ci1 Ci 2 ) ri ,(2.3.1)где Сi1, Ci2 – результаты параллельных определений массовойконцентрации i-го компонента, мг/дм3;ri – значение предела повторяемости i-го компонента, %.Если условие (2.3.1) не выполняется, получают ещѐ два результата всоответствии с методикой измерений.
За результат измерений принимаютсреднее арифметическое значение результатов пяти определений, есливыполняется условие (2.3.2):5 Ci max Ci min 100(Ci1 Ci 2 Ci 3 Ci 4 ) CRi 0,95 ,(2.3.2)где Ci max, Ci min – максимальное и минимальное значения изполученныхпятирезультатовпараллельныхопределениймассовойконцентрации i-го компонента, мг/дм3;CRi0,95 – значение критического диапазона для уровня вероятностиP=0,95 из n – результатов определений.CRi 0,95 f (n) i r(2.3.3)где: ζir – показатель повторяемости i-го компонента, %.Если условие (2.3.2) не выполняется, выясняют причины превышениякритического диапазона, устраняют их и повторяют выполнение измерений врезервной пробе в соответствии с требованиями методики измерений.56Результат анализа представляют в виде:Сi 0,01 i C i ,при P=0,95, где C i − среднее арифметическое значениерезультатов n определений, признанных приемлемыми, мг/дм3;±δi − границы относительной погрешности измерений i-го компонента,%.Математическаяинтерпретациявзаимосвязимеждусоставомкомпонентов экстракта и дегустационной оценкой проводилась с помощьюкорреляционного и дисперсионного анализов с использованием стандартногопрограммного обеспечения Statistica 10.0 [26, 28].Построениематематическихмоделейосновывалосьнаучетеследующих факторов:1.
Степень влияния компонентов экстракта, участвующих в сложенииорганолептических характеристик вина, зависит от их концентрации порогавосприятия и соотношения.2. В связи с тем, что на состав и концентрацию отдельных компонентовзначительное влияние оказывают факторы внешнего воздействия, вкорреляционноманализеиспользовалисьзначения,однородныхгруппопределяемыевиндополнительносоотношениямиотдельныхкомпонентов или их сумм.Гипотетическая модель искомой зависимости может быть представленав виде уравнения:nY = b0 + bi xi +i 1n bj xjj 1(2.3.4)где: xi – переменная, количественно характеризующая содержаниеотдельных компонентов экстракта в однородных группах вин;xj-переменная, количественно характеризующая соотношениекомпонентов вина;57b0, bi, bj – искомые коэффициенты регрессионной модели, подлежащиеэкспериментальному определению.Выборзначимыхорганолептическойфакторов,характеристикойнаиболеевина,тесносвязанныхосуществлялсясметодоммногошагового регрессионного анализа с поочередным исключениемфакторов из модели на основе t- критерия (Стьюдента), которыйхарактеризует значимость коэффициентов парной корреляции (r) междупеременной и дегустационным баллом.Прежде чем подвергнуться многошаговому регрессионному анализуконцентрации экстрактивных компонентов были стандартизированы впределаходнойгруппывинсиспользованиемпроцедурыавтомасштабирования [157, 177].
Оценка значимости уравнения регрессиипроводилась по значению Fнабл-критерия Фишера. Вычисленное значениеFнабл-критерия сравнивали с критическим(табличным) значением Fкр приуровне значимости равном 0,05: если Fнабл> Fкр, то признается статистическаязначимость и надежность уравнения регрессии. Если Fнабл ˂ Fкр, то признаетсястатистическая незначимость и ненадежность уравнения регрессии.Общаясхемапроведенияпредставлена на рисунке 7.исследованийпотемедиссертации58Проведение информационно-патентных исследованийIэтапОбоснование цели и задач исследованийСравнительный анализ существующих способов оценкикачества и современных методов идентификациивинодельческой продукцииIIэтапIIIэтапРазработка новых идентификационных показателейстоловых винСравнительный анализ нормируемых компонентовэкстракта различных групп винИсследование компонентов экстракта вина с использованиемсовременных инструментальных аналитических методовОпределение наиболее значимых критериев качества наоснове изучения соотношений компонентов экстрактаIV этапV этапИзучение корреляционной зависимости между компонентамиэкстракта и органолептической оценкой винРазработка объективных критериев качества однородныхгрупп вин по отдельным показателям состава экстрактивныхкомпонентовКомплексная методика определения подлинности винРисунок 7 – Схема проведения теоретических и экспериментальныхисследований593.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
