Диссертация (1151595), страница 12
Текст из файла (страница 12)
В течение выдержки под вытяжкой несколько раз54взвешивали пробу и доводили до постоянной массы. После чего проводилиминерализацию пробы. После чего проводили минерализацию пробы, какуказано ниже, и ее анализ.4. Отбор, хранение и подготовка проб крови. Отбор крови устандартных норок производился натощак из кончика хвоста или пальца. Дляэтого фиксировали зверя, волосяной покров на кончике хвоста состригали,кожу протирали смесью спирта и диэтилового эфира в соотношении 1:1,ножницами отсекали небольшую часть хвоста 2-4 мм, забор кровипроизводили в одноразовые шприцы, а затем в пробирки. Образцы кровихранили в холодильнике до 3-5 сут.
(от 0° до 4°С), или при -18° С водноразовых полипропиленовых пробирках с герметическими крышками.5. Отбор, хранение и подготовка проб биологических материалов.После забора и исследования крови звери указанного возраста были убиты,шкурки сняты, пробиркованы и запаяны в полиэтиленовые пакеты. С огузкапарной шкурки со стороны мездры с помощью просечки (площадью 2 см 2)быливзятыпробыкожидляустановленияминеральногосостава.Биосубстрат кожи после забора и пробы волос взвешивали с точностью до 1мг и помещали в лабораторную герметичную стеклянную посуду дляпроведения обезжиривания.Хранение биосубстратов кожного покровапроводили при температуре - 20°С.Волосяной покров у щенков месячного возраста брали со всей шкурки,старше 2-х месячного возраста – только с огузка.
Волосы выщипывали ихранили в бумажном пакете при комнатной температуре. Предварительнаяподготовка проб волос к анализу включала тщательную очистку образцовволосяного покрова от загрязнений. Для этого их промывали несколько раз втеплой дистиллированнойводе, затем в спирте-ректификате.образцы обезжиривали ацетономдистиллированнойПотоми снова промывали деионизированнойводой, просушивали в сушильном шкафу при 60°С дотех пор, пока масса навески волос не изменялась. Дляхраненияиспользовали обычные бумажные конверты.556. Определение минерального состава крови, кожного и волосяногопокровов, рационов питания стандартных норок масс-спектрометрией синдуктивно связанной плазмой (ИСП-МС).1.
Разложение проб биосубстратов крови,Для анализа использоваликровь, взятую у тех же самых пушных зверей, у которых затем были взятыбиосубстраты кожного и волосяного покровов. Отбирали в одноразовыешприцы по 1 мл цельной крови. Затем отобранные образцы кровиколичественно переносили в тигли с крышками и высушивали в течение 1,5часов в сушильном шкафу при температуре 110°С и оставляли в закрытомсостоянии на ночь.
Затем образцы высушенной крови прогревали вмуфельной печке в течение 1,5 часа при температуре 250°С, затем добавлялина кончике шпателя сульфат аммония (х.ч.) и прогревали в дальнейшем 1,5часа при 470°С и остужали при комнатной температуре, затем хранили вэксикаторе.Кпробамдобавлялипо1млдеионизированнойконцентрированной азотной кислоты, помещали в сушильный шкаф ивысушивали в течение 3,5 часов при температуре 120°С до состояниявлажных солей. Затем в каждый образец добавляли по 5 мл 1% раствораазотной кислоты, оставляли на 30 минут и фильтровали. Отфильтрованныйраствор переносили в мерную пробирку с пришлифованной пробкой идоводили до 10 мл 1% раствором азотной кислоты.
Образцы до анализахранили в холодильнике. Минеральный анализ крови проводили методомИСП-МС также как и биосубстраты кожного и волосяного покровов и пробырационов питания.2. Разложение проб биосубстратов и рационов питания .Подготовкубиосубстратов и проб рационов питания к элементному анализу с помощьюметодамасс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС)проводили методом открытого разложения.Измельченные, высушенные иобезжиренные образцы волос (кожи) взвешивали на аналитических весах ибрали навеску массой 0,1 г. Для минерализации пробы кормового рационабрали 0,1 г высушенного фарша.
Навеску волос (кожи, пробы фарша)56помещали во фторопластовый цилиндр (PTEF, VitonTM, TeflonTM, PFA),приливали 1 мл деионизированной концентрированной азотной кислоты(о.с.ч.), накрывали защитной лабораторной пленкой и помещали в термоблок(фирма Экрос мод. 4020), разогретый до 115°С, выдерживали в течение 1часа до полного растворения пробы.
Растворенный образец количественнопереносили в мерную полипропиленовую пробирку, троекратно смывая состенок цилиндра, и доводили деионизированной водой до 10 мл. Герметичнозакрывали защитной лабораторной пленкой, перемешивали и проводилиэлементный анализ. Данные об объеме аликвотной части и объемеразведения вводили в программное обеспечение спектрометра вместе сназванием и навеской образца.Чтобы скомпенсировать погрешность разбавления, перед разложениемв пробу добавляли внутренний стандарт (In или Rh), чтобы концентрациявнутреннего стандарта в конечном растворе, направляемом на анализ,составляла примерно 10 мкг/л. Раствор внутреннего стандарта добавляли вовсе холостые и калибровочные растворы.
Раствор холостой пробы готовили свыполнением всех указанных выше операций.3. Приготовление стандартных градуировочных растворов для ИСПМС. Рабочие стандартные растворы готовили путем смешивания несколькихопорных многоэлементных стандартных растворов для масс-спектрометрии,производства Perkin-Elmer. Для калибровки спектрометра использовали трирабочих стандарта, содержащих 10, 40 и 100 мкг/л всех элементов, заисключением ртути, содержание которой составляло 1 и 4 мкг/л в первыхдвух стандартных растворах. Готовили стандартный раствор, содержащийпо 100 мкг/л элементов, используемых для калибровки спектрометра дляопределения матричных элементов Na, Mg, Ca и Zn. Для более точногоопределения матричных элементов был приготовлен стандартный раствор, вкотором их концентрации были приблизительно одного порядка с верхнимиграницами диапазона содержаний элементов в исследуемом растворебиосубстрата с учетом применяемого фактора разбавления. Аналитические57сигналы были обработаны программным обеспечением масс-спектрометраELAN 9000, на основе построения калибровочных линейных регрессий,рассчитанных методом наименьших квадратов, с учетом коррекции фона,сигнала внутренних стандартов, а также с учетом влияния изобарных иполиатомных спектральных наложений.
Работа спектрометра полностьюуправляется и контролируется программным обеспечением WinLab32 воперационной системе Windows 2000. Обработка результатов измеренийсоответствовалаГОСТ8.207.Программноеобеспечениепозволялоосуществить полную автоматизацию измерений, управление системамиввода проб, и статистической обработки. Результат определения каждогоэлемента представлялся как среднее из пяти параллельных измеренийанализируемого образца.4.
Сущность метода. Методоммасс-спектрометриисиндуктивносвязанной плазмой в кожном и волосяном покровах пушных зверей былиопределены следующие элементы: йод, кальций, кобальт, хром, магний,марганец, медь, натрий, селен, цинк с помощью квадрупольного массспектрометра с индуктивно связанной плазмой ELAN 9000. Метод ИСП-МСкомбинирует использование индуктивно связанной плазмы в качествеисточника ионов с квадрупольным масс-спектрометром, выступающим вроли масс-анализатора (фильтра) и дискретно-диодным детектором, которыйиспользуется для регистрации отдельных ионов и их потоков. Индуктивносвязанная плазма, поддерживаемая в специальной горелке, способнаэффективно возбуждать однозарядные ионы из атомов вводимого образца.Далее ионы фокусируются ионно-оптической системой (отделяются отполиатомных и изобарных ионов) и попадают в анализатор массспектрометра, где разделяются по отношению (m/z), где m- масса иона, а zзаряд.
Соответствующий ионный поток регистрируется детектором. Черезмасс-спектрометр в каждый момент времени пропускаются ионы со строгоопределенным соотношением (m/z), которые затем попадают в детектор дляколичественной регистрации. Число соударений за единицу времени58пропорционально количеству атомов каждого определяемого элемента висходном образце. Линейный диапазон зависимости интенсивности сигналаот концентрации на ELAN 9000 превышает шесть-восемь порядков, позволяяв одном цикле сканирования масс-спектра регистрироватьединичныеимпульсы от малых концентраций и ионные токи от высоких концентрацийэлементов.
Диапазон регистрации сигнала осуществлялся благодаря двойнойрегистрации сигналов: импульсный режим одного сегмента детектораиспользуется для подсчета отдельных ионов и аналоговый режим другого –для регистрации ионных токов.Для определения минерального состава биосубстратов использовалсямасс-спектрометр, обладающий диапазоном сканирования масс, а.е.м.: 2-270;динамический диапазон системы детектирования: 1х10 -1 – 1х109 имп/с;диапазон разрешения, а.е.м.: 0,3-3,0. Программное обеспечение массспектрометра позволяло автоматически проводить пробоотбор, калибровку инастройкушкалымассыирабочихпараметровспектрометра,статистическую обработку данных.7.
Определение минерального состава крови, кожного и волосяногопокровов, рационов питания стандартных норокатомно-эмиссионнойспектрометрией с индуктивно связанной плазмой (АЭС).1. Разложение проб биосубстратов крови. Подготовку биосубстратовкрови к элементному анализу с помощьюметодаспектрометрией с индуктивно связаннойплазмойметодом открытого разложения,атомно-эмиссионной(АЭС) проводилитак же, как описано выше прииспользовании метода ИСП-МС. Минеральный анализ крови, кормовыхрационовпроводили методом АЭС так же, как и биосубстраты кожного иволосяного покровов.2.
Разложение проб биосубстратов кожи, волоса, фарша. Подготовкубиосубстратов кожи, волоса, а также пробы фарша к элементному анализу спомощьюметодаатомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивносвязанной плазмой (АЭС-ИСП) проводили методом открытого разложения.59Высушенные и обезжиренные и измельченные образцы волос (кожи),взвешивали на аналитических весах и брали навеску массой 0,1 г. Дляминерализации пробы кормового рациона брали 0,1 г высушенного фарша.Навеску волос, (кожи, пробы фарша) помещаливофторопластовыйцилиндр (PTEF, Viton TM , TeflonTM , PFA), приливали 1 мл деионизированнойконцентрированнойазотнойкислоты(о.с.ч.),накрывализащитнойлабораторной пленкой и помещали в термоблок (фирма Экрос мод.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
