Диссертация (1151292), страница 29
Текст из файла (страница 29)
21. Динамика доли быстрых клеток в процессе инкубациисперматозоидов, обработанных флуорохромом после облученияв стационарном режиме140167контроль-1опытконтроль-2110105ССК, у.е.100959085807570020406080100120140время, минутыРис. 22. Динамика средней скорости сперматозоидов, окрашенных флуорохромом, в процессе инкубации после облученияв стационарном режимеПридействиисперматозоидылазерногоизлучениясвежеполученнойвспермы,стационарномокрашеннойрежименафлуорохромом,обнаружен слабый фотосенсибилизирующий эффект флуорохрома в отношенииопределяемых показателей. Однако, в целом, воздействие лазерного излученияпри данных условиях снижает на 10-15% в процессе инкубации изучаемыепоказатели (средняя скорость движения). Следовательно, действие лазерногоизлучения проявляется лишь в процессе инкубации эякулята в течение 1,5 – 3часов при Т=38°.Воздействиелазерногоизлучениявпроточномрежименасвежеполученный эякулят.
В племцентре ГЦВ (Подольский р-н, Московскойобл.) нами была получена сперма стандартным способом (садка на чучело) отбыка-производителя (бык «Резус»), в объеме 5 мл., которую разбавлялистандартнымсинтетическимразбавителем«OptiXcell»доконцентрацииклеточных тел 6–8 млн. /мл. Далее проводили облучение в проточном режиме спомощью модифицированных излучателей (И-1,И-2)с диаметром световогопятна 5 мм, в соответствии с методикой, описанной в разделе 2. После168облучения прошедший через капилляр объем облученного эякулята собирали вэппендорф и инкубировали в термостате, при380С в течение 3 часов .
До и послеинкубации определеяли: % подвижности (% ПД), % быстрых клеток (% БК),общую (среднюю) скорость движения, мкм/с (ОСД).Результаты исследования представлены в таблице 16 и на рис. 23.Таблица 16 - Изменение показателей качества свежевзятой спермыв процессе инкубации и облучения в проточном режиме(излучатель И-1, диаметр светового пятна 5мм, 0,25 мВт/мм2)№12ВремяДлительностьвоздействия, воздействия,чмин13.15016.15180КонтрольОПД БК % ОСД%4030106291649ОпытОПД БК %%3624,220,614ОСД9857После облучения и инкубации в поле зрения появлялось 6-10%сперматозоидов с закрученным хвостом, тогда как в контроле аналогичноеявление имелом место лишь у 1-2 клеток в поле зрения.Рис.
23. Динамика относительных изменений параметровсперматозоидов в результате облучения в проточном режиме и инкубацииИзменения режима воздействия лазерного излучения затронуло всеизученные параметры половых клеток. В первую очередь это привело к169изменению % представительствабыстрых клеток и характера двигательнойактивности. После инкубации было выявлено изменение относительно контроляхарактера общей подвижности. Наимение выраженным, как и впредыдущихслучаях, оказалось изменение общей скорости движения.Воздействиелазерногоизлучениявпроточномрежименасвежеполученный эякулят, окрашенный флуорохромом Hoechst 33342/pi.Параллельно с исследованием, описанным выше, на том же эякулятепроводили исследование половых клеток, окрашенных флуорохромом Hoechst33342/piдля выявления фотосенсибилизирующего действия флуорохрома.Окрашенные флуорохромом образцы облучали в проточном режиме аналогичнонеокрашенным образцам, а далее инкубировали при 380С в течение 3 часов.Таким образом, контрольные образцы эякулята оказывались общими как дляоблученных окрашенных, так и неокрашенных облученных лазером образцов.Результаты исследования приведены в таблице 17 и на рис.
24, 25.Таблица 17. Изменение показателей качества свежевзятой окрашеннойфлурохромом Hoechst 33342/pi спермы в процессе инкубации и облученияв проточном режиме (излучатель И-1,диаметр светового пятна 5 мм, 0,25 мВт/мм2)№Времявоздействия, ч1213.1516.15Длительностьвоздействия, мин0180Контроль+флуорохромОПД % БК %ОСД3720,6271412257Опыт+флуорохромОПД БК % ОСД%292118,71495,569После облучения и инкубации в поле зрения в необлучённых образцахобработанных флуорохромом появлялось 5% сперматозоидов с закрученнымхвостом, в облученных образцах аналогичное явление имело место на уровне10% клеток в поле зрения.
Кроме того, в окрашенных и облученных образцахувеличилась амплитуда отклонений головки при прямолинейном движении,имело место также движение хвостом вперед, что свидетельствует об170аномальности форм сперматозоидовСопоставление результатов, отраженных в таблицах 16 и 17, показываетвыраженностьфотосенсибилизирующегодействияфлуорохромаHoechst33342/pi в отношении лазерного излучения в проточном режиме, которое проявляется сразу после действия облучения. При этом следует учитывать, что каждый сперматозоид проходил зону действия лазера за 0,07 секунды.
С другойстороны, фотосенсибилизирующий эффект флуорохрома после инкубации практически не проявился.Таким образом, нами не выявлено влияние красителя на способность сперматозоидов к переживанию после облучения.Рис. 24. Изменение параметров сперматозоидов, окрашенныхи неокрашенных флуорохромом, сразу после облучения в проточномрежиме относительно контроля171Рис. 25.
Изменение относительно контроля параметров сперматозоидов,окрашенных и неокрашенных флуорохромом, после облученияв проточном режиме и трехчасовой инкубацииРезультатыисследованийпоказализаметноедействиеврамкахиспользованных критериев лазерного излучения с длиной волны 405 нм наспрематозоиды при условии, что каждая клетка оказывалась в зоне световогопятна лазера диаметром 5 мм в течение 0,07 с.
В результате сужения световогопятна до диаметра 1,5 мм за счет перефокусировки лазера время прохожденияпятна каждой клеткой падает до 0,02 с. Однако, при этом плотность световойэнергии на единицу облучаемой площади в 3 раза возрастала.Воздействие фокусированного лазерного излучения в проточномрежиме на свежеполученный неокрашенный эякулят и окрашенныйфлуорохромом Hoechst 33342/pi эякулят.
Для облучения спермы в проточномрежиме с фокусировкой лазерного луча до пятна диаметром 1,5 мм мыиспользвали излучатель И-1. Условия получения, разбавления, окрашивания иинкубации спермы были полностью аналогичны, описанным выше. Результатыисследования приведены в таблицах 18 и 19.Таблица 18 - Изменение показателей качества свежевзятой спермы впроцессе инкубации и облучения в проточном режиме (излучатель И-1,диаметр светового пятна 1,5 мм, 2,83 мВт/мм2)№Времявоздействия, ч1213.1516.15Длительностьвоздействия, мин0180КонтрольОПДБКОСД%%ОпытОПДБК%%32,319,82813,42212,678,359188,3ОСД7873После инкубации в контроле выявлено около 5% клеток с закрученным хвостом, тогда как в образце, подвергнутом воздействию лазерного облучения, ихколичество увеличилось до 15%.172Таблица 19.
Изменение показателей качества свежевзятой окрашеннойфлурохромом Hoechst 33342/pi спермы в процессе инкубации и облучения впроточном режиме (излучатель И-1, диаметр светового пятна 1,5смм, 2,83мВт/мм2)№Времявоздействия, ч1213.1516.15Длительностьвоздействия, мин0180Контроль+флуорохромОПДБКОСД%%3016,716,510,27856Опыт+флуорохромОПДБКОСД%%226143,373,753После инкубации в необлученных образцах, обработанных флуорохромом(контроль), появилось до 10% клеток с закрученным хвостом, в аналогичных облученных образцах после инкубации их количество возросло до 50% клеток(опыт).
Кроме того, после окрашивания и облучения сперматозоидов возрослаамплитуда отклонений головки при прямолинейном движении и появилось движение хвостом вперед.В целом, характер изменений параметров сперматозоидов после облученияи инкубации аналогичен изменениям при облучении лазером с фокусировкойсветового пятна до диаметра 5 мм.
При этом, изменение средней общей подвижности сразу после облучения зарегистрировано не было, а изменение данногопараметра в облученных образцах после инкубации было менее выражено, чем вконтроле.173Рис 26. Динамика относительных изменений параметровсперматозоидов в результате облучения в проточном режиме(световое пятно 1,5 мм) и инкубацииФокусирование светового пятна приводит к усилению фотосенсибилизирующего действия флуорохрома, что выражается в особенностях морфофункциональных характеристик сперматозоидов во время инкубации.Рис.
27. Фотосенсибилизирующее действие флуорохрома на окрашенныесперматозоиды после облучения сфокусированным (1,5 мм) лазернымлучемв проточном режимеСопоставление последствий воздействия лазера, в зависимости от фокусировкилуча показало, что, несмотря на уменьшение времени прохождения световогопятна от 0,07 с до 0,02 с каждым отдельным сперматозоидом, негативные эф-174фекты усиливались (Рис. 26, 27).Рис. 28. Диаграмма изменений параметров сперматозоидов относительноконтроля, в зависимости от фокусировки лазерного лучаРис.
29. Диаграмма изменений относительно контроля параметровсперматозоидов, обработанных флуорохромом после облученияи инкубации, в зависимости от фокусировки лазерного лучаФотосенсибилизирующее действие флуорохрома при этом заметно прослеживалось не сразу после облучения (ex.temp.), а после инкубации в течение 3часов.При уменьшении диаметра светового пятна время пробега отдельной клеткой светового пятна сокращается от 0,07 с до 0,02 с, но при этом плотностьмощности световой энергии возрастает от 0,25 мВт/мм2 до 2,83 мВт/мм2.
Накаждую единицу объема эякулята, проходящую через капилляр, при диаметресветового пятна 5 мм падает до 7,5 мк ДЖ/ мм3 доза световой энергии, тогда какв случае диаметра пятна 1,5 мм – эта доза снижается до 2,5 мкДж/мм3. Вместе стем, эффект воздействия лазерного излучения во всех случаях определяется необщим количеством падающей световой энергии, а её мощностью. Исследования, проведенные с использованием излучателя И-2 при диаметре световогопятна 5 мм, выявили аналогичный эффект (Рис. 28, 29).175Воздействие некогерентного УФ-излучения в проточном режиме насвежеполученный неокрашенныйи окрашенный флюрохромом эякулятHoechst 33342/pi эякулят. Оценка воздействия некогерентного УФ-излучениянами проведена в племцентре ГЦВ (Подолский р-н, Московской обл.), где былаполучена сперма стандартным способом (садка на чучело) от быкапроизводителя (бык «Резус»), в объеме 5 мл.
Сперму разбавляли стандартнымсинтетическим разбавителем «OptiXcell» до концентрации клеточных тел 6–8млн./мл. При облучении клеток в проточном режиме с диаметром световогопятна 5 мм излучателя И-3 определяли % подвижности (% ППД), % быстрыхклеток (% БК), и общую (среднюю) скорость движения, мкм/с (ОСД).Параллельно проводили окрашивание этого же эякулята флуорохромом Hoechst33342/pi для выявления его фотосенсибилизирующего действия.Окрашенные флуорохромом образцы облучали в проточном режимеаналогично неокрашенным образцам, далее инкубировали при 380С в течение 3часов. Таким образом, контрольные образцы эякулята оказывались общими какдля облученных окрашенных, так и неокрашенных облученных лазеромобразцов.В результате исследования было обнаружено отрицательное воздействиелазерного облучения на морфофункциональные показатели спермы, котороепроявилось непосредственно после лучевого воздействия (рис.
30).176Рис. 30. Изменения относительно контроля параметровсперматозоидов сразу после воздействия некогерентного излучения405 нм 0,125 мкВт/мм2 в проточном режимеЭффекты повреждения клеток, выявленные нами, были выражены значительно слабее, чем при аналогичном воздействии лазера. При этом оказалось,что при таком относительно слабом по мощности воздействии флуорохром непроявляет фотосенсибилизирующего действия на сперматозоиды, а наоборот,обладает некоторым фотопротекторным эффектом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
