Диссертация (1151292), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Приготовление мазков из спермы, их окрашивание, микроскопия дляпервичного обнаружения кампилобактерий и установления их морфологическиххарактеристик.2. Посев изучаемого биоматериала на специальные питательные среды дляоценки культуральных свойств выделенных микроорганизмов с целью первичной идентификации кампилобактерий.3. Идентификация кампилобактерий до вида бактериологическим методом«Золотой стандарт» референсным методом с использованием галерии стриповAPI системы, с прилагаемыми к ним средами-суспензиями и реактивами дляучета реакции при поддержке програмного обеспечения.На основании проведенных исследований разработаны и утверждены вустановленном порядке методические рекомендации «Методы исследований физических, биологических свойств и морфофункциональный анализ качествакриоконсервированной спермы производителей» (№ МЭ 1/0024, от 23 октября2017 года).3.1.3. Изучение антибиотикорезистентности Pseudomonas aeruginosa,выделенной из криоконсервированной спермыОдной из актуальных проблем в ветеринарной медицине в целом и акушерско-гинекологической практике в частности, до настоящего времени остаетсясложность преодоления существующей антибиотикорезистентности большинства возбудителей инфекционных заболеваний, обсеменяющих сперму животных.Проблему приобретенной множественной лекарственной устойчивости бактерий и грибов декларируют многие развитые страны, причем в некоторых изних, например, в Великобритании и США – её рассматривают как угрозу нацио-197нальной безопасности.Бактерия Pseudomonas aeruginosa в результате приобретенной устойчивостии патогенности широко распространена во внешней среде и может не только обсеменять сперму производителей в период получения, разбавления, хранения ит.д, но и вызывать воспалительные процессы у животных и выделяться с эякулятом.
Поэтому изучение изменения уровня антибиотикорезистентности P. aeruginosa к различным антимикробным препаратам в последние годы является актуальной задачей для медицыны животных и человека.В результате проведенных исследований было установлено, что P. aeruginosa чрезвычайно устойчива к стрептоциду и пенициллину. В 2006-2011 гг. уровень выделения устойчивых к данным антибиотикам псевдомонад составил100%. Причем, несмотря на то, что за последние 5 лет применение в составесинтетических разбавителей спермы этих антимикробных препаратов былопрактически сведено на нет, снижение устойчивости у P.
aeruginosa к стрептоциду и пенициллину не произошло, что свидетельствует о хромосомной, а не оплазмидной антибиотикорезистентности синегнойной палочки (рис. 43).ОсновнойОсновнойОсновнойОсновной%ОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновной200620072008Стрептоцид200920102011ПенициллинРис. 43. Динамика уровня антибиотикочувствительности P. aeruginosa,выделенной из спермы, к стрептоциду и пенициллинуПроведенный нами мониторинг антибиотикочувствительности P. aeru-198ginosa к гентамицину показал, что в результате снижения спроса на данный антибиотик и замену его на другие препараты, с 2008 года наблюдается снижениеуровня выделения из спермы быков-производителей гентамициноустойчивыхпсевдомонад с 72% до 66% (рис.
44).ОсновнойОсновнойОсновнойОсновной%ОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновной200620072008200920102011Рис. 44. Динамика уровня антибиотикочувствительности P. aeruginosaк гентамицинуПолученные данные свидетельствуют о том, что в будущем разбавителиспермы, содержащие гентамицин, можно будет применять для санации спермыживотных, обсемененной синегнойной палочкой.Нерациональное использование нового антибиотика энрофлона в составеразбавителей спермы животных явилось следствием приобретения P. aeruginosaмножественной лекарственной устойчивости (рис.
45).199ОсновнойОсновнойОсновной%ОсновнойОсновнойОсновной200620072008200920102011Рис. 45. Динамика уровня антибиотикочувствительности P. aeruginosaк энрофлонуС 2007 г отмечается нарастание уровня выделения устойчивых к энрофлону псевдомонад с 75% до 90%. Дальнейшее применение данного антибиотикадля санации спермы быков-производителей, контаминированных P. aeruginosa,является бесперспективным (Рис.46)..ОсновнойОсновнойОсновной%ОсновнойОсновнойОсновнойОсновной200620072008200920102011Рис.
46. Динамика уровня антибиотикочувствительности P. aeruginosaк энрогенуАнализ уровня выделения P. aeruginosa, устойчивых к энрогену, показал,200что в 2006 г из спермы быков-производителей было выделено 39% антибиотикоустойчивых культур псевдомонад, к 2007 г уровень он снизился на 1%. Однако в2008 и 2009 г выделение антибиотикоустойчивых штаммов возросло до 42%. К2010 уровень устойчивости псевдомонад к энрогену вновь снизился на 3%, а к2011 году вырос на 1%.
Такая неравномерная динамика уровня выделенияустойчивых к энрогену штаммов P. aeruginosa может свидетельствовать о непостоянном спросе на данный антибиотик или его недостаточном потреблении,связанном с дефицитом препарата. Тем не менее, просматривается тенденцияувеличения уровня выделения устойчивых к энрогену культур P. aeruginosa.ОсновнойОсновнойОсновнойОсновной%ОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновной200620072008200920102011Рис. 47.
Динамика уровня антибиотикочувствительности P.aeruginosaк спермецинуМаксимальнаячувствительностьизвсехизученныхантибиотиковP.aeruginosa была установлена к спермецину. Однако в последние годы отмечается тенденция роста уровня выделения псевдомонад, устойчивых к данному антибиотику (Рис.
47).В окружающей среде, а также в ветеринарной практике, чаще всего встречаются многокомпонентные микробные системы, смешанные инфекции, гдеимеют место различные взаимодействия макроорганизмов.201За последние 5 лет зафиксирован рост частоты встречаемости антибиотикорезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделяемых из спермы производителей, в результате нерационального использования антибиотиков, в томчисле и антимикробных препаратов нового поколения.Уровень выделения устойчивых к стрептоциду и пенициллину P.aeruginosaв 2006-2011 гг составил 100%.С 2008 года наблюдается снижение уровня выделения из спермы гентамициноустойчивых псевдомонад с 72% до 66%.С 2007 г отмечается нарастание уровня выделения устойчивых к энрофлонупсевдомонад с 75% до 90%.Установлена тенденция увеличения уровня выделения из спермы производителей устойчивых к энрогену культур P.aeruginosa.
В 2006 г было выделено39% устойчивых культур, в 2011 г уровень устойчивости псевдомонад к энрогену составил 40%.Из всех изученных антибиотиков P.aeruginosa была наиболее чувствительнак спермецину. Однако в последние годы отмечается тенденция резкого ростауровня выделения псевдомонад, устойчивых к данному антибиотику – в 2006 гбыло выделено 9% спермециноустойчивых P.aeruginosa, в 2011 г – 35%.Таким образом, применение антибиотиков для санации спермы быковпроизводителей является важной проблемой, особенно, если сперма обсемененасинегнойной палочкой, обладающей множественной лекарственной устойчивостью.Необходимо изыскивать новые антибактериальные препараты или усовершенствовать уже известные, создавая комплексные антибиотики широкого спектра действия, обладающие низкой токсичностью в отношении спермиев и высокой антимикробной активностью.2023.2.
Определение уровня обсемененности спермы микромицетамиСогласно ГОСТ 32198-2013, исследование спермы на наличие грибов должно проводиться высевом на мясопептонный агар, не предназначенный для выявления грибов, приспособленных к развитию в условиях низких температур, идифференциацией выявляемых грибов.В настоящее время существуют питательные среды, позволяющие проводить более полное выявление и дифференциацию патогенных и условнопатогенных грибов.В работе были проведены микологические исследования 20 проб спермы сиспользованием современных дифференциальных сред. Были апробированы селективные добавки, проведено испытание рабочих характеристик питательныхсред для выявления разных видов грибов, подобраны условия инокуляции икультивирования.Метод заключается в посеве подготовленного образца спермы на набор питательных сред (Сабуро с глюкозой, картофельно-глюкозный агар, среда с дихлораном и бенгальским розовым (DRBC), хромогенная среда для дифференциации грибов рода Candida) с дальнейшим культивированием грибов и их идентификацией.Результат считали положительным, если, как минимум, на двух чашках изодного разведения обнаруживался рост аналогичных грибов, при этом в контрольных чашках роста грибов не наблюдали.С целью изучения уровня обсемененности спермы быков-производителейплесневыми и дрожжеподобными грибами проводили разведение образца спермы стерильным пептоно-солевым раствором или стерильным 0,9 % растворомнатрия хлорида.С целью достижения воспроизводимости результатов, для приготовленияразбавителя использовали обезвоженные основные компоненты или обезвоженный готовый разбавитель.
Приготовление разбавителя осуществляли строго поинструкции производителя.203Исходную суспензию готовили в стерильной пробирке, используя девятикратный по отношению к объёму пробы объём разбавителя.В стерильную пробирку с 9,0 мл разбавителя стерильно переносили 1,0 млисходной суспензии и перемешивали, тщательно промыв наконечник дозатораразбавителем.
Таким образом получали десятикратное разведение исходной суспензии или стократное (1:100) разведение исследуемой пробы.Последующие разведения готовили аналогично, используя для приготовления каждого разведения новую стерильную пипетку. Кратность разведенияопределяли, исходя из ожидаемого уровня контаминации спермы грибами такимобразом, чтобы на инокулированных чашках Петри вырастали изолированныеколонии микромицетов.Инокуляция и инкубация. Для исследования одной пробы использовали 2чашки Петри со средой Сабуро (или КДА) и две чашки Петри со средой DRBCна каждое из разведений.В чашку Петри с питательной средой вносили по 1 мл суспензии из двухсмежных разведений и равномерно распределяли материал по всей поверхностиагара покачиванием чашек или стерильным L – образным шпателем толщинойне более 2 мм.Инокулированные чашки Петри инкубировали аэробно, крышками вверх, вгоризонтальном положении в термостате при температуре 28 ± 1 °C в течение 5суток.Одновременно инкубировали две неинокулированные чашки для контролястерильности питательной среды.После первичного учёта результатов чашки оставляли на 14 суток для обнаружения медленно растущих грибов.Чашки с посевами просматривали один раз в сутки в течение всего срокакультивирования.
Отбирали чашки, на которых наблюдали образование колониймикроорганизмов. При необходимости из колонии каждого морфологическоготипа готовили микропрепарат и исследовали его под контролем микроскопа дляподтверждения того, что выделенные микроорганизмы являются грибами.204Результат микологической экспертизы спермы считали отрицательным, если на всех чашках рост грибов не был обнаружен, все чашки с контрольнымисредами были чистыми.Результат считали положительным, если хотя бы на одной из чашек, независимо от разведения, обнаруживали рост грибов, все чашки с контрольнымисредами чистые. В случае получения положительного результата исследованиепроводили повторно, используя двукратное количество образца и двукратноеколичество питательных сред.В случае повторного положительного результата идентифицировали выделенные грибы и определяли уровень их патогенности.Было исследовано 16 проб спермы в соответствии с МР «Культуральноемикологическое исследование спермы» (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
