Диссертация (1151292), страница 27
Текст из файла (страница 27)
В последние годы особое вниманиеуделяют влиянию свободнорадикального окисления на фертильность спермиев.Нормальное функционирование сперматозоидов – подвижность и целостностьакросомы требует присутствия физиологического количества активных формкислорода (АФК), основным источником которых являются митохондрии. Развитие митохондриальной дисфункции сперматозоидов приводит к низкоэнергетическому состоянию, а также гиперпродукции АФК, вызывая окислительныйстресс.Митохондриальная дисфункция – это обширная группа патологических состояний, обусловленных генетическими, структурными, биохимическими дефектами митохондрий, приводящих к нарушению синтеза АТФ и гиперпродукции АФК (Рис. 12).Выделяют два параметра митохондриальных дисфункций: первичную –врожденный генетический дефект и вторичную - под действием различных факторов: окислительного стресса, облучения и т.д.При исследовании проб спермы, разделенной по полу, от 20 быковпроизводителей выявлено 4 быка с повышенным индексом фрагментации ДНК(более 30 % в головке сперматозоида) и 6 быков с фрагментированной мт-ДНК(было зафиксировано свечение хвостовой части, то есть установлена и зафиксирована митохондриальная дисфункция сперматозоидов быков-производителей).абв152Рис 12.
Фрагментация ДНК сперматозоидаа) фрагментация ДНК сперматозоида в области головки на фоне здоровых;б) фрагментация ДНК сперматозоида как в головке, так и в хвостовой части; в)фрагментация ДНК сперматозоида в области шеечной части-митохондриальнаядисфункцияВсеисследованныепробыспермы,разделеннойпополу,несоответствовали ГОСТ Р 54633-2011, число сперматозоидов с прямолинейнопоступательным движением составляло менее 40 %.Такимобразом,нашиисследованияподтвердилифактсниженияподвижности сперматозоидов, а именно явление астеноспермии у всех гамет, атакже установили причину данного явления.По нашему мнению, митохондрии спермиев быков-производителей играютключевую роль в обеспечении энергией для осуществления двигательной активности сперматозоидов, что является основным и решающим фактором, определяющим фертильность быка-производителя, где сила движения сперматозоидаотражает их способность к оплодотворению.Основным источником АТФ является митохондриальное окислительноефосфорилирование и анаэробный гликолиз.
В условиях МД сперматозоидовпроисходит увеличение степени восстановленности NAD+, что способствует повышению скорости, снижению энергообеспечения клетки, а также увеличениюпроницаемости пор митохондриальных мембран.На основании проведенных исследований разработаны и утверждены вустановленном порядке методические рекомендации «Определение индексафрагментации ДНК в замороженной сперме у животных-производителей (№ МЭ1/0020, от 20 октября 2017 года)».1532.6 Разработка режимов лазерного излучения для воздействия насвежеполученный и криоконсервированный эякулят спермы примоделировании технологии получения сексированного семениВ настоящее время в ряде технологических процессов, связанных с подготовкой семенного материала к искусственному осеменению крупного рогатогоскота или к криоконсервации, используют процедуру, включающую воздействиена семенной материал излучения лазера в УФ-области (365 нм).
При этом такжеприменяют некоторые красители, так или иначе обладающие фотосенсибилизирующим действием. О допустимости такого воздействия с точки зрения нежелательных экономических или генетических последствий в литературе имеютсяразрозненные и довольно противоречивые сведения. Специальных полномасштабных исследований влияния лазерного УФ- излучения на фертильностьспермы не проводили.Необходимое для ответа на поставленный вопрос исследование, включающее изучение действия УФ на сперматозоиды крупного рогатого скота, взависимости от дозы, длины волны, мощности и т.п., до сих пор в РФ также непроведено.
Кроме того, важно ответить на вопрос о специфичности лазерноговоздействия на клетки спермы, где помимо высокой спектральной плотностиэнергии присутствуют еще некоторые специфические факторы, такие каккогерентность излучения и т.п.Вкачествекритериев оценки воздействия, помимо общепринятых вживотноводстве (в основном, морфофизиологических и цитохимических –микроскопическоеисследованиеподвижностиижизнеспособностицелесообразно добавить еще биохимические и биофизические критерии, в томчисле определение энергетической функции митохондрий , активностиферментов акросомы, устойчивости показателей к снижению рН и т.п.Самым главным, в этом случае является прямая оценка эффектов УФ-154лазерного воздействия – оценка результатов осеменения подобным материаломкак через криоконсервацию, так и минуя ее.
При этом, не следует исключать израссмотрения возможность негативных последствий не только в несколькихпоколениях потомства, но также и для оплодотворяемых таким материаломкоров. В качестве примера можно привести патент США №2442324 «Способполучения нескольких эмбрионов и млекопитающего заданного пола».Изобретение решает проблему выбора пола в потомстве путем разделениясперматозоидов в эякуляте по полу (разделение Х- и У- сперматозоидов) передосеменением.
Последнее, в свою очередь, достигаютпутем проточно-цитометрического разделения сперматозоидов.В процессе разделения разбавленный эякулят окрашивают с помощьюфлюорохромногокрасителя Hoechst 33342 (при концентрации 38 мкМ).Краситель окрашивает все типы сперматозоидов, но разная длина Х-хромосомыи Y-хромосомы создает разные уровни окрашивания. Поэтому воздействиелазерного излучения (365 нм) на окрашенные сперматозоиды позволяет системераспознавания сортировать клетки в зависимости от типа хромосомы. Такимобразом, в проточном цитометре, оборудованном дополнительной системойсортировки клеток, помиморяда «обычных» стрессорныхвоздействий(разбавление путем смешивание с капсульной жидкостью), движение в струепод давлением, добавлено еще действие красителя и лазерного УФ-облучения.Для проведения исследований по действию лазерного УФ излучения былисконструированы и изготовлены всего 4 излучателя.
2 «когерентных» (лазерных)с длиной волны 405 нм (верхняя граница ближнего УФ излучения). Излучателидалее обозначены как И-1 (5 мВт) и И-2 (10 мВт). Также 2 «некогерентных», обас длинами волн 405 и 465 нм, различающиеся по мощности. Далее излучателиобозначены как И-3 (маломощный) и И-4 (более мощный).При эксплуатации в режиме «405 нм» оба некогерентных излучателя служили в качестве контроля специфичности лазерного излучения. При эксплуатации в режиме «365 нм» исследовали прямое действие некогерентного УФизлучения с длиной волны 365 нм на объект, поскольку на данную длину волны155когерентные (лазерные) источники излучения оказались экономически недоступны.В «когерентных излучателях» источниками световой энергии служили лазерные модули диодной накачки STLL-405-5 (мощность излучения 5 мВт, длинаволны 405 нм – И-1) и STLL-405-10 (мощность излучения 10 мВт, длина волны405 нм – И-2).
Конструкции обоих лазерных модулей позволяли регулироватьфокусировку луча.Были использованы 2 режима: с диаметром пятна 5 мм (S= 19,6 мм2) и диаметром пятна 1,5 мм (S=1,8 мм2). Таким образом обеспечивали плотность энергии в световом пятне 0,25 мВт/мм2 и 2,83 мВт/мм2 для лазера с мощностью (влуче) 5 мвт и 0,50 мВт/мм2 и 5,66 мВт/мм2 для лазера с мощностью (в луче) 10мВт.Конструктивно излучатели представляют собой штатив с кремальерой, соединенных в общем корпусе.
Штатив обеспечивал крепление кюветы с объектом, кремальера - вертикальное перемещение тубуса с лазерным модулем присмене облучаемого образца.Питание лазеров осуществлялось от стабилизированного по току источника,в соответствии с техническими паспортами токи питания составляли 200 мА длялазерного модуля с мощностью 5 мВт и 400 мА для молуля с мощностью 10мВт.Кюветное отделение обеспечивало два варианта облучения: стационарное ипроточное. Для стационарного облучения использовался цилиндрический эппендорф (стандартная пробирка Эппендорфа) емкостью 2 мл, которую устанавливали в крепежное отверстие на штативе.В режиме проточного облучения в крепежное отверстие штатива устанавливали проточную кювету-капилляр.Непрерывный проток объекта через капилляр осуществляли путем автоматической шприцевой подачи со скоростью 33 мм3/с.
Внутренний диаметр капилляра составлял около 0,75 мм (S=0,9 мм2).В качестве излучателя И-3 служил осветитель ОИ-28 с галогенной лампой156КГМ-7 (источник сплошного спектра в диапазоне 300 – 1000 нм) и комплектомиз двух сменных интерференционных светофильтров (365 нм и 405нм). Питаниелампы осуществлялось стабилизированным током 1,5 А от специального источника. Штатив с кюветным отделением в излучателе И-3 был тот же, что и в излучателях И-1 и И-2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
