Диссертация (1151292), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Детекция ПЦР-продуктов в зависимости от вида мутации:1) методом пиросеквенирования – однонуклеотидные замены;2) методом электрофореза в агарозном геле – протяженные делеции и / илиинсерции;3) секвенирование фрагментов генома по Сенгеру – микроделеции и небольшие вставки нуклеотидов в определенном положении гена;4.
Анализ и интерпретация результатов исследований.Этап экстракции и очистки ДНК состоял в выделении ДНК из замороженной спермы сорбционным методом с использованием набора "ДНК-сорб С"(ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) с модификациями ФГБУ ВГНКИ.Для идентификации мутаций спермы SDM, SMA, W, BH2, SAA, OS. AM.DD, DW, MA, DM использовали по одной паре праймеров, позволяющих амплифицировать фрагменты генов SPAST (мутация SDM), KDSR (мутация SMA),PNPLA8 (мутация W), TUBD1 (мутация BH2), SOUX (мутация SAA), SLC4A2(мутация OS), HES4, AGRN (мутация AM), PRKG2 (мутация DW), NHLRC2(мутация DD), MAN2B1 (мутация MA), MSTN (мутация DM) в области мутации.При амплификации фрагмента ДНК генов SPAST, KDSR, PNPLA8, TUBD1,PRKG2, NHLRC2, MAN2B1. Для повышения специфичности ПЦР применяли131«горячий старт» с восковой прослойкой.После завершения реакции ПЦР-продукты, предназначенные для идентификации мутаций SDM, SMA, W, BH2, DD, МА, DW, направляли на пиросеквенировние.
ПЦР-продукты, предназначенные для идентификации мутаций SАА иDM, направляли на электрофорез в агарозном геле с последующим секвенированием, ПЦР-продукты, предназначенные для идентификации мутаций OS и AM на электрофорез в агарозном геле.Нуклеотидную последовательность фрагментов амплифицированной ДНКопределяли методом пиросеквенирования.
Метод пиросеквенирования, реализуемый на базе платформы генетического анализатора PyroMark (Qiagen, Германия), предназначен для определения нуклеотидных последовательностей коротких фрагментов в области генетических полиморфизмов. Метод основан на детекции высвобождающегося пирофосфата при элонгации цепи ДНК в результатесинтеза второй цепи ДНК на матрице одноцепочечной ДНК. Пирофосфат высвобождается после встраивания соответствующего нуклеотида во вновь синтезируемую цепь.
В результате ферментативного превращения пирофосфата регистрируется хемилюминесцентный сигнал.Первым этапом анализа явилась наработка ампликона, содержащего полиморфный генетический локус. Затем проводили пробоподготовку ампликона.ПЦР-продукт инкубировали с частицами сефарозы, покрытыми стрептавидином.При помощи полуавтоматической вакуумно-фильтрационной станции проводили щелочную денатурацию ампликона и серию отмывок, в результате которыхобразовался одноцепочечный ПЦР-продукт, который иммобилизируется натвердую поверхность (планшет для секвенирования) и используется как матрицав реакции пиросеквенирующего синтеза. К одноцепочечному биотинилированному ПЦР-продукту добавляли секвенирующий праймер, который отжигается вобласти анализируемого генетического локуса.
Заключительным этапом анализаявилось проведение реакции пиросеквенирующего синтеза и анализ полученныхрезультатов. Детекцию результатов пиросеквенирующего синтеза проводили автоматически в режиме реального времени с помощью пиросеквенаторов серии132PyroMark, позволяющих в течении 10-15 мин секвенировать до 96 образцов одновременно.Для последующего анализа аллельного состояния полиморфизма (мутацииSDM, SMA, W, BH2, DD, МА, DW) использовали пирограммы, удовлетворяющие всем критериям оценки качества.Определение нуклеотидной последовательности фрагментов амплифицированной ДНК методом капиллярного электрофореза (секвенирование поСенгеру). Сущность метода заключается в определении нуклеотидной последовательности целевого фрагмента гена (600-1000 п.н.) для выявления вставок илимикроделеций в определенном положении.Перед секвенированием амплифицированного фрагмента генов SOUX (мутация AS), MSTN (мутация DM) проводили очистку ПЦР-продукта от невключившихся праймеров и дНТФ.
Для очистки брали 5 мм3 ПЦР-продукта, добавляли 2 мм3 реагента для очистки продуктов ПЦР (смесь ферментов «GMLExoSAP»: экзонуклеаза I и щелочная фосфатаза SAP). Экзонуклеаза I деградирует одноцепочечные фрагменты ДНК, в том числе невключившиеся праймеры,щелочная фосфатаза гидролизует свободные дезоксинуклеотиды. Раствор сначала инкубировали при температуре 37 ºС в течение 15 мин, затем - при температуре 80 ºС еще в течение 15 мин.Реакцию секвенирования по Сенгеру с флуоресцентно мечеными терминаторами (дидезоксинуклеотидами) проводили методом cycle sequence на амплификаторе «GeneAmp PCR System 2720» («Applied Biosystem», США).
ОчищеныеПЦР-продукты секвенировали с прямого АS-F праймера или с обратного DM-Rпраймера. В тонкостенные пробирки вместимостью 0,2 см3 вносили 1 мм3 очищенного ПЦР-продукта, 0,8 мм3 АS-F или DM-R праймера молярной концентрации 1 мкмоль/дм3, 2,2 мм3 воды деионизованной. а также 1 мм3 смеси реагентадля секвенирования, содержащего буфер, дезоксинуклеотидтрифосфаты, флюоресцентно-меченныедидезоксинуклеотидтри-фосфаты,ДНК-полимеразуAmpliTaq Gold.Термоциклирование проводили на амплификаторах с термостатируемой133крышкой, соблюдая прописанный в инструкции режим.Продукты секвенирования очищали от избытка дНТФ, флуоресцентномеченных ддНТФ, секвенирующего праймера и солей осаждением полинуклеотидов изопропиловым спиртом. Ко всему объему реакционной смеси добавляли30 мм3 75 %-ного изопропилового спирта и инкубировали в течение 20 мин прикомнатной температуре.
Затем центрифугировали при 13000 об/мин 20 мин иудаляли надосадочную жидкость. К полученному осадку добавляли 100 мм3 75%-ного изопропилового спирта, центрифугировали еще раз при 13000 об/мин 2мин и удаляли надосадочную жидкость. Высушивали осадок в термостате притемпературе 65 оС в течение 10-15 мин и растворяли в 20 мм3 формамида. Полученные анализируемые пробы в формамиде переносили в 96-луночный планшет,закрывали уплотнителем и подвергали тепловой денатурации при температуре95 °С в течение 3 мин, а затем при температуре 4 °С – в течение 3 мин.Подготовленные анализируемые пробы, содержащие продукты секвенирования, разделяли методом капиллярного электрофореза с детекцией сигналафлюоресценции.
Подготовку, все этапы испытания и интерпретацию результатов выполняли в соответствии с инструкцией по эксплуатации генетическогоанализатора. Программное обеспечение генетического анализатора автоматически анализирует полученные сигналы (хроматограммы), оценивает качествопрочтения и определяет последовательность нуклеотидов. Результатом анализаявляется расшифрованная последовательность нуклеотидов, приведенная надпиками хроматограммы в формате abi файла.Для последующей интерпретации результатов использовали нуклеотидныепоследовательности на хроматограммах с высокой интенсивностью сигналафлюоресценции и хорошо разделенными пиками.Достоверность прочтения пиков определяется автоматически программойSequencing Analysis 5.2, критерием служит величина оценки точности идентификации нуклеотидов QV, необходимое условия достоверности чтения пика QV ≥20.Положительные контроли ПЦР (К+)134В качестве положительных контролей ПЦР использовали плазмиды, содержащие целевые вставки (ПЦР-продукты) в векторной плазмиде pAl-2 (Евроген).Данный вектор предназначен для быстрого клонирования продуктов ПЦР безпредварительной обработки рестриктазами или экзонуклеазами.Плазмида для идентификации мутации «SAA» содержит клонированныйфрагмент ДНК AS503 размером 503 п.н.
Плазмида для идентификации мутации«OS» содержит клонированный фрагмент ДНК OS475 размером 475 п.н.Плазмида для идентификации мутации «AM» содержит клонированныйфрагмент ДНК AM574 размером 574 п.н. Плазмида для идентификации мутации«DM» содержит клонированный фрагмент ДНК DM592 размером 592 п.н.Программное обеспечениe. Для выбора олигонуклеотидных праймеров использовали программное обеспечение «Biotage», «Primer Premier 5.0», «PrimerSelect DNAstar», «Oligonucleotide Properties Calculator», «Primer-Blast» (NCBI)[2]. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали программы BLAST, «GenomeCompiler», а также программу «AlignX» из пакета Vector NTI Express (Thermofisher Scientific, США). Для поиска ДНК последовательностей интересующих генов Bos taurus использовали базу данных GenBank(NCBI, США), а также программу BLAST (NCBI).Результаты работы были получены при использовании утвержденных вустановленном порядке методов и ГОСТов, на сертифицированном оборудовании и определяются достаточным количеством проведенных исследований набольшой выборке животных.Микробиологические и генетические исследования спермопродукции былипроведены на базе лицензированных и аккредитованных лабораторий ФГБУ«Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».Цифровой материал был подвергнут статистической обработке по методикеЯковенко А.М.
«Биометрические методы анализа качественных и количественных признаков в зоотехнии» (2013).1352.2. Определение качества спермы быков-производителей взависимости от физико-химических свойств спермы и технологии ееполученияВ настоящее время за рубежом, в ряду линейки технологических процессов,связанных с подготовкой семенного материала к искусственному осеменениюкрупного рогатого скота и его криоконсервации, используют процедуру сортертехнологии, которая включает воздействие на семенной материал излучения лазера в УФ-области (365 нм).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
