Диссертация (1151292), страница 26
Текст из файла (страница 26)
Увеличение внутриклеточной концентрацииСа2+ активирует Са2+-зависимую фосфолипазу, в результате изменяется уровеньвторых посредников - циклических нуклеотидов. Вслед за этим активируетсяпротонная аденозинтрифосфатаза, что приводит к увеличению внутриклеточного рН. Увеличение концентрации Са2+ в цитозоле и повышение рН в головке143сперматозоида запускают акросомную реакцию.Между акросомной и ядерной оболочкой находится тонкий слой вещества –перинуклеарная зона.
Именно в ней выявлен комплекс белков, который считаютфактором активации ооцитов. Их высвобождение из головки сперматозоида вцитоплазму ооцита ведет к активации ооцита, включая завершение мейоза и защиту от полиспермии.При акросомальной реакции наружная мембрана акросомы и клеточнаямембрана сливаются с формированием мелких пузырьков, отделяющихся от головки сперматозоида. При этом из акросомы спермии млекопитающих высвобождают протеазы (в том числе акрозин), гиалуронидазу, гликозиды, липазы,нераминидазы и фосфатазы. Данные ферменты расщепляют молекулы прозрачной оболочки (zona pellucida), что позволяет сперматозоиду преодолеть этот барьер. Zona pellucida (zona striata, «блестящая оболочка») представляет собой прозрачную эластичную оболочку, окружающую яйцеклетку.
Основная функцияzona pellucida заключается в препятствии проникновения более одного сперматозоида в яйцеклетку.Выявление в эякуляте повышенного содержания сперматозоидов с аномальной акросомой – одна из причин идиопатического бесплодия сельскохозяйственных производителей, даже при нормативных параметрах спермограммы. Это связано с тем, что у сперматозоидов с агенезом акросомы изменяется проницаемость плазматической мембраны для ионов Са, теряется ихспособность прикрепляться к мембране ооцита.Акросома спермиев быка имеет менее плотную консистенцию, чем другиеих части.
Поэтому, при хранении спермы дегенеративные изменения возникаютв первую очередь в акросоме.144акросомаголовкаядрошейкахвостРис. 10. Расположение акросомы у сперматозоидаПричиной повреждения акросомы у сперматозоида является нарушениепроцесса сперматогенеза с генетической детерминацией к данному заболеванию.Дегенерация акросомы выражается в разрушении плазматической мембраны,что приводит к снижению фертилизационной способности эякулята быковпроизводителей.Для успешного оплодотворения коров при искусственном осеменениисперматозоиду необходимы:− моторный аппарат, с помощью которого он может преодолевать большоерасстояние от влагалища до верхней трети яйцепровода, где происходит оплодотворение ооцита, при этом сперматозоид движется навстречу яйцеклетки противтока жидкости, преодолевая реотаксис;− наличие интактной акросомы, с помощью которой осуществляется пенетрация сперматозоидом оболочек ооцита;− собственно ядро сперматозоида для переноса в ооцит генетического материала отцовской гаметы;− центриоль зрелого сперматозоида, обеспечивающая митотическое деле-145ние и дробление эмбриона;− низкий процент или отсутствие фрагментированных участков ДНК.Оценка аномалий головки сперматозоидов и акросомы обычно проводятпри помощи специальных методов окрашивания, либо функциональных тестов.Эти методы визуализируют наличие и целостное состояние самой акросомыспермия.Отделом по контролю качества и стандартизации генетического материалаи препаратов, применяемых при воспроизводстве животных ФГБУ «ВГНКИ»,совместно с сотрудниками ФБГУ «ВИЖ им.
Л.К. Эрнста», были разработаныметодические рекомендации по определению целостности акросомы сперматозоида с помощью тест - набора красителей Дифф-Квик.Для оценки биологического профиля состояния акросомы сперматозоида внастоящее время используют ряд методик по ее окрашиванию. Методика, указанная в ГОСТ № 32277 – 2013, а именно пункт 8.4, не отвечает современнымтребованиям определения целостности акросомы сперматозоида. Указанный вГОСТе краситель эозин/нигрозин лучше всего использовать для определенияколичества мертвых и живых сперматозоидов, но не для дифференциации морфофункциональных характеристик изучаемых половых клеток.Нами проведен сравнительный анализ информативности дифференцированного окрашивания сперматозоидов красителями эозин/нигрозин и ДиффКвик.Дифф-Квик - это современный набор реактивов, предназначенный длябыстрого окрашивания биоматериала.
Он широко используется в медицине дляклинических исследований крови и эякулята человека. Нами впервые он использован для исследования спермы крупного рогатого скота. Было выявлено, чтоэффективность окрашивания красителями Дифф-Квик была выше таковойэозин/нигрозином, поскольку представляется возможность определять не толькоколичество сперматозоидов с акросомой, но и при этом установить морфологические особенности (качество) самой акросомы сперматозоидов.Нами были отработаны этапы и условия пробоподготовки, время окраши-146вания и параметры оценки результатов (предложена форма расчета количествасперматозоидов с поврежденной акросомой в %).Было показано, что сперматозоиды крупного рогатого скота с поврежденной акросомой изменяют свои тинкториальные свойства под воздействием красителя Дифф-Квик и приобретают светло-розовый цвет (рис.
11 в, г), в то времякак в норме они имеют коричневый оттенок (рис. 11 а, б).авбгРис. 11. Микроморфологические особенности сперматозоидов (х-100):а, б) сперматозоид с целой акросомой; в, г) сперматозоид с поврежденнойакросомой147Нами было исследовано 30 спермопроб быков-производителей втрехкратной повторности на определение целостности акросомы сперматозоидов. Средний показатель количества сперматозоидов с интактной акросомой составил 87%, что находится в пределах нормы (не менее 60%) по ГОСТ № 32277– 2013 (табл. 11).При исследовании проб спермы, разделенной по полу, от 20 быков былопоказано, что во всех исследуемых образцах средний показатель количествасперматозоидов с интактной акросомой составил у 19 животных 78%, а у одногобыка Huijben DG Buick содержание целостной акросомы было менее 50 %, чтоне соответствует нормам ГОСТ Р 54633-2011.Таблица 11 - Средние показатели результатов исследования спермы разделенной по полу (в трёхкратной повторности)№Быки производителиСпермопроб исследовано1234567891011121314151617181920Sahara BalooNewry BarberShanael Planet BarakaHuijben DG BuickCogent DiegoWiltor CorvetteWilter Cruise VG88Wilter DrummerTW GoodwhoneWoodmarsh MellowWintersell Milo EX92Diepenhoek ModelmanBB MontrealBB Toy Missile EX92Ards ParamountSahara JacobCogent BillCattrona Hotshot EX93Heavenly ParadiseInsider11111111111111111111Поврежденная акросомаКоличество исследованийIIIIII232725712114776163562023231114389111012711253027465313434191115252630273537243630Итог%Норма поГОСТдо 50%2510660221510102853315273332соотв.соотв.соотв.не соотв.соотв.соотв.соотв.соотв.соотв.соотв.соотв.соотв.соотв.соотв.соотв.соотв.соотв.соотв.соотв.соотв.148Предлагаемая нами методика с использованием тест - набора Дифф-Квикпозволяет получать результаты с высокой степенью достоверности и являетсяболее эффективной по сравнению с другими методами окрашивания акросомысперматозоида животных-производителей.На основании проведенных исследований разработаны и утверждены вустановленном порядке методические рекомендации «Определение целостностиакросомы сперматозоидов в замороженной сперме у животных-производителей»(№ МЭ 1/0021, от 16 октября 2017 года).1492.5.
Разработка методики подсчета индекса фрагментации ДНК-хроматинасперматозоидаФрагментация ДНК сперматозоидов – относительно недавно открытая причина бесплодия. Она включает двухцепочечные и одноцепочечные разрывы молекулы ДНК.В норме хроматин зрелых сперматозоидов плотно упакован, чтобы защитить ДНК от потенциальных повреждающих воздействий во время транзита пополовым путям самца и самки. Высокая плотность упаковки хроматина достигается за счет замены белков-гистонов, характерных для всех соматических клетокорганизма, на специальные переходные белки и протамины. Пусковым механизмом служит модификация гистонов: специфическое метилирование, ацетилирование, фосфорилирование или убиквитинилирование. Этот процесс начинается вмейозе и продолжается до выхода сперматозоидов из придатка.В настоящее время выделяют несколько этапов структурных аномалий хроматина сперматозоидов:− нарушение физической целостности молекулы ДНК в виде разрыва однойили обеих полинуклеотидных цепей – фрагментация;− дефекты ядерных белков, препятствующих замене гистонов на протамины и последующему уплотнению ДНК;− нарушение пространственной третичной структуры хроматина.В последнее десятилетие многими исследователями установлен факт снижения фертильности и повышения риска врожденных уродств как у продуктивных, так и у непродуктивных животных при увеличении уровня фрагментацииДНК в сперматозоидах, а также рост процента невынашивания плода (около 40% выкидышей), риски спонтанных абортов, а самое главное, нарушения развития зародыша.Данные о влиянии нарушений соотношения между гистонами и протаминами менее очевидны, так как у млекопитающих известны два типа протаминов:протамин 1, характерный для всех видов, и протамин 2, найденный лишь у неко-150торых видов, в том числе у человека.
В ряде проведенных исследований не обнаружено существенной корреляции между дефицитом протамина и нарушением оплодотворения, а также качеством эмбрионов.В других работах показано, что дефицит протамина 2 способствует повреждению ДНК сперматозоидов и приводит к гибели эмбрионов животных. Авторы отмечают и то, что небольшая часть ДНК сперматозоидов (не более 15%)остается связанной с гистонами. Уменьшение доли протаминов делает хроматинболее чувствительным к повреждающим воздействиям.В ходе ремоделинга с участием типоизомераз возникают одноцепочечные идвухцепочечные его разрывы, характерные для постмейотического созреванияпри сперматогенезе.В настоящее время мы можем охарактеризовать данный процесс в следующем формате - начало конденсации хроматина коррелирует с увеличением разрывов в ДНК, затем разрывы репарируются, а лигирование разрывов происходитза счет транзиторных белков.В процессе эпидидимального транспорта сперматозоидов тиоловые группыпротаминов окисляются, образуя дисульфидные связи, стабилизируя ядро сперматозоида в еще более компактную структуру.
Процесс уплотнения хроматинаинактивирует транскрипцию генома сперматозоида, защищает её и стабилизирует ДНК самого сперматозоида. Разрывы ДНК, возникающие в ходе ремоделинга,также рассматривают как источник разрывов ДНК в сперматозоидах.Поскольку появление разрывов в структуре ДНК при репликации – неизбежный процесс, в норме существуют механизмы биологического «ремонта» генома сперматозоида – яйцеклетка способна восстанавливать повреждения ДНКоплодотворившего её сперматозоида, однако, когда повреждение ДНК сперматозоида слишком велико, репаративных способностей яйцеклетки оказываетсянедостаточным и как следствие - попытки неэффективной репарации спермальной ДНК яйцеклеткой могут вызывать мутагенный эффект, приводящий к врожденным аномалиям.Качественные и количественные изменения параметров спермы – уменьше-151ние количества сперматозоидов (олигоспермия), снижение их подвижности(астеноспермия), появление большого количества сперматозоидов с измененнойформой (тератозоспермия).Одним из наиболее важных патогенетических механизмов развития бесплодия у самцов считают окислительный стресс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
